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Revista Cubana Aliment Nutr 1996;10(2)
Instituto de Nutrición e Higiene de los Alimentos

Detección de la desoxirribonucleasa termoestable (termonucleasa) directamente en el alimento

Armando Bécquer Lombard,1 Virginia Leyva Castillo1 y César Lara Ortiz,2
  1. Licenciado (a) en Bioquímica. Investigador (a) Agregado (a).
  2. Técnico Medio en Microbiología.

RESUMEN

Se inocularon in vitro diversos alimentos de origen animal, con la cepa de Staphylococcus aureus FRI-S6, productora de la enterotoxina estafilocócica del serotipo B y de la nucleasa termoestable. Se comprobó la concentración microbiana de los inóculos, mediante siembra en superficie en medio Baird Parker. Se halló termonucleasa en alimentos que contenían concentraciones microbianas de 106 - 107 UFC/g.

Palabras clave: DESOXIRRIBONUCLEASAS/análisis STAPHYLOCOCCUS AUREUS/enzimología; PRODUCTOS DE LA CARNE/análisis; PRODUCTOS PESQUEROS/análisis; SUSTITUTOS DE LA LECHE MATERNA/análisis; MEDIOS DE CULTIVO.

INTRODUCCION

La detección de la desoxirribonucleasa termoestable estafilocócica (termonucleasa) en los alimentos, se utiliza como una prueba indirecta de la presencia de grandes cantidades de Staphylococcus aureus en los alimentos, así como de la posible formación de enterotoxina estafilocócica.

La producción de esta enzima se inhibe en anaerobiosis y se estimula por la presencia de oxígeno, requiere iones calcio para su actividad enzimática, posee un pH óptimo de 8,6 y se precipita de cultivos fluidos con sulfato de amonio. Su termoestabilidad (resiste temperatura de 130 oC por 16,6 min) es la única asociación con el crecimiento de S. aureus. Esta relación ha motivado el desarrollo de diferentes métodos para detectar esta enzima en el alimento y utilizarla como pesquisaje en los alimentos susceptibles a la contaminación de S. aureus.1-6 El objetivo de este trabajo es establecer en nuestro medio un método para la detección de la enzima termonucleasa directamente en el alimento y de esta forma facilitar el diagnóstico presuntivo de la posible presencia de S. aureus anterotoxigénicos, pues la detección de la enterotoxina suele utilizar métodos costosos, engorrosos y de no fácil ejecución en laboratorios pequeños, y a su vez los análisis microbiológicos requieren mayor tiempo.

MATERIAL Y METODO

Se utilizó la cepa de S. aureus FRI-S6, productora de la enterotoxina estafilocócica y de la termonucleasa.

Los medios de cultivo fueron el agar DNasa-azul de toluidina para la detección de la termonucleasa y el agar Baird Parker para la enumeración de los microorganismos.

Los experimentos se realizaron con embutidos cárnicos, leche y pescados obtenidos de empresas productoras. Las muestras sólidas se homogeneizaron en batidora doméstica con igual cantidad de agua destilada por 1 min, se colocaron en baño de María a ebullición durante 30 min y en baño de hielo por 15 min, se diluyeron en 400 mL de agua destilada, se agitaron, se midió el pH y se esterilizaron en autoclave a 121 oC durante 15 min. Las muestras de leche no fueron sometidas a este proceso, solamente fueron esterilizadas.

Determinación de unidades formadoras de colonias por gramo

A partir de un cultivo de 24 h de S. aureus en cuñas de agar nutriente, se preparó una suspensión en un tubo con 10 mL de suero fisiológico estéril hasta obtener la concentración inicial deseada utilizando la escala de Mc Farland, y se hicieron diluciones posteriores hasta obtener la concentración deseada para el inóculo del alimento.

La concentración microbiana de las distintas diluciones se comprobó mediante la siembra de 0,1 mL de cada dilución en la superficie del medio de Baird Parker incubado a 37 oC durante 24 h. El alimento inoculado se incubó a 37 oC durante 24 h en cultivo estático, pasado este tiempo se realizaron diluciones de éste y se sembraron en la superficie del medio Baird Parker para conocer la multiplicación que se había producido, antes de hacer la prueba de la termonucleasa directamente en el alimento.

Extracción de la enzima (modificación al método de Tatini)

Nuestra modificación al método de Tatini se refiere al tiempo empleado en la centrifugación de las muestras y a la introducción de cloruro de calcio (activador de la enzima) en la fase en que las proteínas se encuentran precipitadas (F).

- Se mezclaron 20 g de la muestra con 40 mL de agua destilada.

- Se ajustó el pH a 3,8 con HCl 1N.

- Se centrifugó a 5 000 rev/min durante 45 min a 5 oC.

- Se decantó el sobrenadante y se adicionó 5 mL de ácido tricloroacético en frío.

- Se centrifugó a 5 000 rev/min durante 45 min a 5 oC.

- Se decantó y el precipitado se disolvió en 4 mL de tris-buffer-metil-aminometano y en 1 mL de Cl2Ca 0,1M y se ajustó el pH a 8,6 con NaOH 1N.

- Se calentó a ebullición en baño de María durante 15 min y se enfrió aproximadamente a 50 oC.

- Se depositó la extracción en hoyuelos habilitados en agar-DNasa azul de toluidina.

- Se incubó a 37 EC durante 24 h. La reacción se consideró positiva cuando en el medio de cultivo, alrededor de los hoyuelos inoculados apareció una coloración rosada.

RESULTADOS

En la tabla aparecen las concentraciones iniciales del inóculo para cada uno de los alimentos estudiados y su correspondiente concentración después de la incubación a 37 EC durante 24 h. Todas las muestras fueron positivas a la producción de la termonucleasa.
TABLA. Crecimiento de Staphylococcus aureus FRI-S6
 
 Alimentos Concentración inicial del inóculo  (UFC/g)  Concentración después de la incubación (UFC/g)
Embutido "emitacao" 1,5 2,5 x 107
Jamonada 3 x 10  2,6 x 108 
Jamonada  3 x 102  5,0 x 108
Jamón Visking  1,5 x 10  3,8 x 108 
Jamón Visking 1,5 8,0 x 107 
Tilapia 1,5 1,8 x 107 
Jurel 1,5 2,8 x 107 
Tilapia 3 x 104  > 109 
Leche fresca 1,5 2,4 x 106
Leche en polvo reconstituida 1,5 x 102  4,2 x 106

DISCUSION

Los valores encontrados en este estudio con respecto al conteo de microorganismos viables y a la producción de termonucleasa en leche son similares a los reportados por Koupal y Deibel,7 aunque ellos no hallaron producción de la enzima cuando obtuvieron valores de 1,4 x 107 UFC/g con un período de incubación de 4,5 h a 37 oC.

En los embutidos los resultados obtenidos en este estudio se aproximan a los de Prasad et al.,8 quienes iniciaron su ensayo con inóculos de 5 x 102 UFC/g, y hallaron actividad enzimática positiva cuando el cultivo fue incubado por 24 h a 37 oC con un recobrado de S. aureus de 4,1 x 107 UFC/g de alimento, pero no ocurrió de igual manera cuando se usó la misma temperatura y períodos de incubación de 5 y 10 h, pues informaron valores de 1,4 x 104 y 2,1 x 106 UFC/g del alimento.

Tatini9 detectó la termonucleasa en 5 muestras de embutido con concentraciones de S. aureus de 1,2 x 106 a 4,3 x 108 UFC/g después de 24 h de incubación a 37 oC.

Nuestro estudio corroboró que la termonucleasa se puede detectar en alimentos que contengan concentraciones de microorganismos en el orden de 106 UFC/g. Cuando no es posible utilizar métodos serológicos que resultan más costosos para la detección de las enterotoxinas, se puede aplicar esta prueba indirecta que sugiere la multiplicación invasiva de S. aureus.

Este método es útil para la emisión de un diagnóstico rápido; es un método sencillo, económico y de escasa manipulación que puede ser introducido en la red nacional de laboratorios de Higiene y Epidemiología.

AGRADECIMIENTO

Al Combinado Cárnico "Antonio Maceo" ("Tauro"), la planta "La Lechera" y el Puerto Pesquero de La Habana, por habernos facilitado gentilmente las muestras de productos alimentarios.

SUMMARY

Different food from animal origin were inoculated in vitro with the strain of FRI-S6 Staphylococcus aureus, which produces serotypes B staphylococcal enterotoxin and thermostable nuclease. The microbial concentration of inocula was proved by growing in a Baird Parker culture medium surface. Thermonuclease was found in food containing microbial concentrations of 106 - 107 CFU/g.

Key words: DEOXYRIBONUCLEASES/analysis; STAPHYLOCOCCUS AUREUS/enzymology; MEAT PRODUCTS/analysis; FISH PRODUCTS/analysis; MILK SUBSTITUTES/analysis; CULTURE MEDIA.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

  1. Halpin-Dohnalek IM, Marth EH. Production of extracellular compounds and behavior in foods. Food Prot 1989;52:267-81.
  2. Sterski A, Szabo R, Tood EC, Thacker C, Dickie N, Akhtar M. Staphylococcus aureus growth and thermostable nuclease and enterotoxin production in canned salmon and sardines. J Food Prot 1986; 49(6):428-35.
  3. González Fandos E, Otero A, Sierra ML, García López ML, Prieto M. Effect of three commercial standards of growth of Staphylococcus aureus and enterotoxins (A-D) and thermonuclease production in broth. Int J Food Microbiol 1995;24(1/2):321-7.
  4. Gay JM. Staphylococcal gastroenteritis. Modern food microbiology. 4 ed. New York: Academic Press, 1992;455-78.
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  6. Puig de Centrobi ON. Toxinas bacterianas. Toxicología de los Alimentos. Argentina: Hemisferio Sur, 1995;cap. 6:91-109.
  7. Koupal A, Deibel RH. Rapid qualitative method for detecting Staphylococcal nuclease in food. Appl Env Microbiol 1978;35:1193-7.
  8. Prasad M, Chandiramini NK, Mandokhot UV. Thermonuclease as an indicator of growth of S. aureus and production of enterotoxin. J Food Sci Technol 1986;23:1-4.
  9. Tatini SR. Thermonuclease as an indicator of Staphylococcal enterotoxins in food. Antinutrients and natural toxicants in food. En: Ory RL, ed. Food and nutrition. Westpor CT:: Press, Inc., 1985;53-73.
Recibido: 29 de diciembre de 1995. Aprobado: 25 de abril de 1996.

Lic. Armando Bécquer Lombard. Instituto de Nutrición e Higiene de los Alimentos. Infanta No. 1158, municipio Centro Habana, Ciudad de La Habana 10300, Cuba.

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