Palabras clave: DESOXIRRIBONUCLEASAS/análisis STAPHYLOCOCCUS AUREUS/enzimología; PRODUCTOS DE LA CARNE/análisis; PRODUCTOS PESQUEROS/análisis; SUSTITUTOS DE LA LECHE MATERNA/análisis; MEDIOS DE CULTIVO.
La producción de esta enzima se inhibe en anaerobiosis y se estimula por la presencia de oxígeno, requiere iones calcio para su actividad enzimática, posee un pH óptimo de 8,6 y se precipita de cultivos fluidos con sulfato de amonio. Su termoestabilidad (resiste temperatura de 130 oC por 16,6 min) es la única asociación con el crecimiento de S. aureus. Esta relación ha motivado el desarrollo de diferentes métodos para detectar esta enzima en el alimento y utilizarla como pesquisaje en los alimentos susceptibles a la contaminación de S. aureus.1-6 El objetivo de este trabajo es establecer en nuestro medio un método para la detección de la enzima termonucleasa directamente en el alimento y de esta forma facilitar el diagnóstico presuntivo de la posible presencia de S. aureus anterotoxigénicos, pues la detección de la enterotoxina suele utilizar métodos costosos, engorrosos y de no fácil ejecución en laboratorios pequeños, y a su vez los análisis microbiológicos requieren mayor tiempo.
Los medios de cultivo fueron el agar DNasa-azul de toluidina para la detección de la termonucleasa y el agar Baird Parker para la enumeración de los microorganismos.
Los experimentos se realizaron con embutidos cárnicos, leche y pescados obtenidos de empresas productoras. Las muestras sólidas se homogeneizaron en batidora doméstica con igual cantidad de agua destilada por 1 min, se colocaron en baño de María a ebullición durante 30 min y en baño de hielo por 15 min, se diluyeron en 400 mL de agua destilada, se agitaron, se midió el pH y se esterilizaron en autoclave a 121 oC durante 15 min. Las muestras de leche no fueron sometidas a este proceso, solamente fueron esterilizadas.
La concentración microbiana de las distintas diluciones se comprobó mediante la siembra de 0,1 mL de cada dilución en la superficie del medio de Baird Parker incubado a 37 oC durante 24 h. El alimento inoculado se incubó a 37 oC durante 24 h en cultivo estático, pasado este tiempo se realizaron diluciones de éste y se sembraron en la superficie del medio Baird Parker para conocer la multiplicación que se había producido, antes de hacer la prueba de la termonucleasa directamente en el alimento.
Extracción de la enzima (modificación al método de Tatini)
Nuestra modificación al método de Tatini se refiere al tiempo empleado en la centrifugación de las muestras y a la introducción de cloruro de calcio (activador de la enzima) en la fase en que las proteínas se encuentran precipitadas (F).
- Se ajustó el pH a 3,8 con HCl 1N.
- Se centrifugó a 5 000 rev/min durante 45 min a 5 oC.
- Se decantó el sobrenadante y se adicionó 5 mL de ácido tricloroacético en frío.
- Se centrifugó a 5 000 rev/min durante 45 min a 5 oC.
- Se decantó y el precipitado se disolvió en 4 mL de tris-buffer-metil-aminometano y en 1 mL de Cl2Ca 0,1M y se ajustó el pH a 8,6 con NaOH 1N.
- Se calentó a ebullición en baño de María durante 15 min y se enfrió aproximadamente a 50 oC.
- Se depositó la extracción en hoyuelos habilitados en agar-DNasa azul de toluidina.
- Se incubó a 37 EC durante 24 h. La reacción se consideró positiva cuando en el medio de cultivo, alrededor de los hoyuelos inoculados apareció una coloración rosada.
| Alimentos | Concentración inicial del inóculo (UFC/g) | Concentración después de la incubación (UFC/g) |
| Embutido "emitacao" | 1,5 | 2,5 x 107 |
| Jamonada | 3 x 10 | 2,6 x 108 |
| Jamonada | 3 x 102 | 5,0 x 108 |
| Jamón Visking | 1,5 x 10 | 3,8 x 108 |
| Jamón Visking | 1,5 | 8,0 x 107 |
| Tilapia | 1,5 | 1,8 x 107 |
| Jurel | 1,5 | 2,8 x 107 |
| Tilapia | 3 x 104 | > 109 |
| Leche fresca | 1,5 | 2,4 x 106 |
| Leche en polvo reconstituida | 1,5 x 102 | 4,2 x 106 |
En los embutidos los resultados obtenidos en este estudio se aproximan a los de Prasad et al.,8 quienes iniciaron su ensayo con inóculos de 5 x 102 UFC/g, y hallaron actividad enzimática positiva cuando el cultivo fue incubado por 24 h a 37 oC con un recobrado de S. aureus de 4,1 x 107 UFC/g de alimento, pero no ocurrió de igual manera cuando se usó la misma temperatura y períodos de incubación de 5 y 10 h, pues informaron valores de 1,4 x 104 y 2,1 x 106 UFC/g del alimento.
Tatini9 detectó la termonucleasa en 5 muestras de embutido con concentraciones de S. aureus de 1,2 x 106 a 4,3 x 108 UFC/g después de 24 h de incubación a 37 oC.
Nuestro estudio corroboró que la termonucleasa se puede detectar en alimentos que contengan concentraciones de microorganismos en el orden de 106 UFC/g. Cuando no es posible utilizar métodos serológicos que resultan más costosos para la detección de las enterotoxinas, se puede aplicar esta prueba indirecta que sugiere la multiplicación invasiva de S. aureus.
Este método es útil para la emisión de un diagnóstico rápido; es un método sencillo, económico y de escasa manipulación que puede ser introducido en la red nacional de laboratorios de Higiene y Epidemiología.
Key words: DEOXYRIBONUCLEASES/analysis; STAPHYLOCOCCUS AUREUS/enzymology; MEAT PRODUCTS/analysis; FISH PRODUCTS/analysis; MILK SUBSTITUTES/analysis; CULTURE MEDIA.
Lic. Armando Bécquer Lombard. Instituto de Nutrición e Higiene de los Alimentos. Infanta No. 1158, municipio Centro Habana, Ciudad de La Habana 10300, Cuba.