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Revista Cubana Aliment Nutr 1996;10(2)

Obtención y evaluación de un suero aglutinante polivalente para la identificación presuntiva de Vibrio cholerae 01

1. Especialista de I Grado en Microbiología. Investigadora Agregada. Centro de Investigaciones Científicas de la Defensa Civil.
2. Licenciado en Microbiología. Investigador Agregado. Centro de Investigaciones Científicas de la Defensa Civil.
3. Especialista de II Grado en Microbiología. Investigador Agregado. Profesor Instructor. Instituto de Nutrición e Higiene de los Alimentos.
4. Licenciada en Biología. Investigadora Agregada. Instituto de Nutrición e Higiene de los Alimentos.
5. Licenciada en Microbiología. Investigadora Auxiliar. Instituto Nacional de Higiene, Epidemiología y Microbiología.

RESUMEN

Palabras clave: VIBRIO CHOLERAE/aislamiento y purificación; AGLUTINATION/immunología; CONEJOS.

INTRODUCCION

La severidad de la enfermedad en humanos varía, la forma más debilitante y seria es la causada por el Vibrio cholerae 01.^1,2

En 1991 el cólera epidémico se reportó en Perú y su extensión era probable para el resto del área teniendo en cuenta además que su endemicidad está muy relacionada con la persistencia del agente causal en su reservorio natural.^3,4

Desde entonces se reactivó nuestro Sistema de Vigilancia Epidemiológica que incluyó el estudio de alimentos marinos, aguas y muestras clínicas.

A pesar de los adelantos disponibles, el diagnóstico del cólera continúa siendo convencional^4-7 y resulta epidemiológicamente importante identificar presuntivamente al Vibrio cholerae 01, por ello es necesario disponer de un suero aglutinante polivalente. El objeto de nuestro trabajo fue obtener dicho suero.

MATERIAL Y METODO

Se preparó a partir de cultivo en agar sange al 5 % de Vibrio cholerae 01 serotipo Ogawa e Inaba, obtenido del cepario del Centro de Investigaciones Científicas de la Defensa Civil y sometido a control de pureza mediante coloración de gram, identidad serológica frente a sueros aglutinantes (Wellcome y Difco) y observación del estado de disociación.

Comprobadas las características de los cultivos, se cosecharon y resuspendieron en solución salina a la concentración deseada, comparándola visualmente con la escala de MacFarland.^6,8

Inmunización

Se realizó en conejos machos, cepa Nueva Zelandia de 3 kg de peso y sanos. El esquema se extendió por 6 semanas y se utilizó la vía endovenosa, 2 veces por semana, para dosis crecientes de antígeno hasta 1,5 mL. Una semana después de la última inoculación se desangraron los animales y se separó el suero por centrifugación.^6,8

Determinación del título y dilución de trabajo del suero obtenido

Se desarrolló la técnica de aglutinación en lámina ampliamente usada como método semicuantitativo.⁹ Se usó el suero puro y diluciones dobles progresivas con solución salina 0,85 %. Un volumen fijo de suero se enfrentó a un volumen fijo de antígeno homólogo preparado igualmente en solución salina y a una concentración mayor que el tuvo 10 de MacFarland. Se agitó manualmente la lámina y se observó la aglutinación.

Los resultados se dieron por cruces y se determinó el tiempo de aparición de la reacción.⁹

Evaluación de sueros frente a cepas heterólogas⁹

Se procedió de la forma descrita anteriormente con la diferencia de utilizar cepas heterólogas para determinar la reactividad cruzada.

Cepas

Homólogas. Vibrio cholerae 01: Cepa LIMA, SOYO, Luanda, Lobito, 569B, Lov15, Zaire, 17, 1395-4, 1395-6, 1395, E7946, TH 749, Futura, 3083, Ecuador, 1569, VC 12, NIH 1696, JBK 70, NIH41, Malawi, VC 13, CA 401, LIMA (F), Mex (de diferentes orígenes).

Heterólogas. Vibrio cholerae 01:24 cepas aisladas de alimentos (pescados), aguas (superficial y residual) y heces de pacientes, otros Vibrios: 15 aislados de ostiones, camarones, langostas; enterobacterias y bacilos gramnegativos, 28 de colección (ATCC): 10 y aislados de alimentos y agua superficiales 18; otros microorganismos: 2.

Elaboración del producto final

Se utilizó finalmente solución bufferada fosfatada a pH 7,2-7,4 con caseína como estabilizador y tiomersal como preservativo.

Comprobación de las características funcionales del producto final elaborado

Se desarrolló la técnica de aglutinación en lámina y se colocaron sobre ésta (portaobjeto o de aglutinación) 2 gotas separadas de antisuero y solución salina (una gota 20 m L).

Se adicionó a cada gota una asada del cultivo seleccionado o 10 m L de una suspensión densa de éste y se mezcló bien cada una. Se rotaron las láminas suavemente durante 1 min y se utilizó luz indirecta sobre fondo oscuro o aglutinoscopio con iluminación oblicua para la observación.

Se utilizaron cepas conocidas como controles. Se consideró positiva la aglutinación cuando fue completa y típica en 30 s o hasta 1 min. Se utilizaron paralelamente los sueros de referencia mencionados y los parámetros que se evaluaron fueron los siguientes:

Sensibilidad. Se comprobó al enfrentar los sueros a 26 cepas de Vibrio cholerae 01. La reacción esperada era de aglutinación completa y típica en 30 s o hasta 1 min, es decir, que se produjera una reacción positiva.

Especificidad. Se determinó al enfrentar el suero a cepas de Vibrio cholerae 01, otros Vibrios, enterobacterias, bacilos gramnegativos y otros microorganismos. La reacción esperada era negativa.

Para ello se aplicaron las siguientes fórmulas:

                 a 

Sensibilidad: ------- x 100 

               a + c

a = verdaderos positivos.
b = falso positivo.
c = falso negativo.
d = verdaderos negativos.

                  D 

Especificidad: ------- x 100 

                b + d

Se realizó en los Laboratorios DAVIH, Instituto de Nutrición e Higiene de los Alimentos, Instituto Nacional de Higiene, Epidemiología y Microbiología e Instituto Finlay.

RESULTADOS

Con el esquema de inmunización empleado se obtuvieron títulos hasta 1:2048 y se seleccionaron para la elaboración final aquellos con 1:32 o mayores, que no presentaron reactividad cruzada con microorganismos de prueba diferentes a Vibrio cholerae 01, que frente a estos últimos aglutinaron fuertemente (3-4 cruces) entre 30 y 1 min.

Para comprobar la sensibilidad del suero se enfrentó a 26 cepas de Vibrio cholerae 01 llegadas a nuestro laboratorio y todas tuvieron resultados positivos de aglutinación para el 100 % de sensibilidad, mostrando igual comportamiento que los sueros comerciales utilizados (tabla 1).

Igualmente la especificidad fue de 100 % cuando el suero se enfrentó a 69 cepas de Vibrio cholerae 01, otros Vibrios, enterobacterias, bacilos gram-negativos y otros microorganismos. Sólo la cepa Escherichia coli (ATCC 25922) se mostró autoaglutinable y aglutinó con suero positivo (tabla 2).

DISCUSION

El esquema de inmunización no resultó ni laborioso ni largo y sí reproducible en nuestras condiciones.

La técnica de aglutinación simple en lámina para la evaluación de los sueros y producto final resultó como es conocida útil, sencilla y rápida de hacer.

Se muestra que el estudio del suero fue realizado frente a cepas obtenidas de diferentes orígenes y resultó útil su uso con resultados satisfactorios.

Debido a la importancia clínica y epidemiológica del cólera, resulta extremadamente importante determinar lo más rápido posible ante colonias sospechosas aisladas de alimentos, aguas o pacientes su identidad serológica y reportar presuntivamente su identificación que conlleva a decidir la estrategia de control de la enfermedad.^1,3,5,10

Este suero se extendió a los laboratorios de la red de salud de nuestro país y es utilizado aún por los centros que lo evaluaron inicialmente con buenos resultados.

CONCLUSIONES

El suero permitió identificar claramente Vibrio cholerae 01, por lo que resultó útil su uso.

La tecnología de obtención de dicho suero resultó fácil de desarrollar y reproducible en nuestras condiciones.

SUMMARY

Key words: VIBRIO CHOLERAE/isolation and purification; AGGLUTINATION/immunology; RABBITS.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Kelly MT, Hickman-Brenner FW. Vibrio. En: Balows WJ, et al. Manual of clinical microbiology. 5 ed. Washington, DC: American Society for Microbiology. 1991;384-95.
2. Scott RR. Infections diseases associated with molluscan shellfish consumption. Clin Microbiol Rev 1994;7(4):419-25.
3. Wachsmuth IK, Bopp CA, Evins GM, Chen F, Fields PI, Wells JG, et al. Characteristics of toxigenic Vibrio cholerae 01 strains isolated from epidemic cholera in South America in 1991. Twentyseventh joint conference on cholera and related diarrheal diseases 1991;19-20.
4. West PA, Brayton PR, Bryant TN, Colwell RR. Numerical taxonomy of vibrios isolated from aquatic environments. Int J System Bacteriol 1986;36(4):531-43.
5. Joshiksu N. Screening of aquatic samples for Vibrio cholerae serotype 01 by a dot blot method and latex agglutination. Appl Environ Microbiol 1990;56(6):1547-50.
6. Sugiyama J, Gondaira F, Matsuda J, Soja M, Terada Y. New method for serological typing of Vibrio cholerae 01 using a monoclonal antibody sensitized latex agglutination test. Microbiol Immunol 1987; 31(4):387-91.
7. Gustaffson B. Monoclonal antibody based enzyme Linked immunosorbent assay for identification and serotyping of Vibrio cholerae 01. Microbiol 1984;20(6):1180-5.
8. Singleton FL. Effects of temperature and salinity on Vibrio cholerae growth. Appl Environ Microbiol 1982;44:1047-58.
9. Davis BD, Dulbecco R, Eisen HN, Ginsberg HS, Wood WB, McCarty M. Tratado de microbiología. 2 ed. Barcelona: Salvat, 1979:777-816.
10. Islams MS, Alam MJ, Khan SI. Freshwater pond ecosystem as a reservoir of Vibrio cholerae 01 in an endemic area of Bangladesh. Twentyseventh joint conference on cholerae and related diarrheal diseases 1991;215.

Dr. Martha J. Alfonso González. Centro de Investigaciones Científicas de la Defensa Civil. Carretera de Tapaste y 8 vías, San José de las Lajas, La Habana, Cuba.

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