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Revista Cubana Aliment Nutr 1996;10(2)
Instituto de Nutrición e Higiene de los Alimentos

Importancia de la detección de enterotoxinas estafilocócicas

Armando Bécquer Lombard,1 Lidya Mota de la Garza,2 y César Lara Ortiz3
  1. Licenciado en Bioquímica. Investigador Agregado. Instituto de Nutrición e Higiene de los Alimentos.
  2. Master en Ciencias. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. Instituto Politécnico Nacional, Mexico, DF.
  3. Técnico en Procesos Biológicos. Instituto de Nutrición e Higiene de los Alimentos.

RESUMEN

Se presenta un compendio sobre la clasificación, patogenicidad, obtención, purificación, métodos de análisis y otros aspectos de las enterotoxinas estafilocócicas y los avances obtenidos en el estudio de éstas a nivel internacional y, en particular, en Cuba.

Palabras clave: ENTEROTOXINAS/aislamiento y purificación; INTOXICACION ALIMENTARIA ESTAFILOCOCICA

El crecimiento de Staphylococcus aureus se asocia a la producción de compuestos extracelulares, tales como hemolisinas, nucleasas, coagulasas, lipa-sas y enterotoxinas.

Las intoxicaciones alimentarias producidas por las enterotoxinas constituyen un problema mundial y guardan estrecha relación con los hábitos dietéticos regionales.

ENTEROTOXINAS ESTAFILOCOCICAS

Las enterotoxinas son proteínas de cadena simple no ramificada compuestas por cantidades relativamente grandes de lisina, tirosina, ácido aspártico y ácido glutámico. Los pesos moleculares oscilan entre 28 000 y 35 000 daltons, son solubles en agua y presentan una alta termoestabilidad. La producción de enterotoxinas por cepas de Staphylococcus aureus se afecta por la calidad de los nutrientes y el pH del sustrato, la temperatura, la atmósfera, el cloruro de sodio, otros compuestos químicos y los microorganismos competidores. Los alimentos más asociados con los brotes de intoxicación alimentaria son las ensaladas frías, productos avícolas (principalmente ensalada de pollo), dulces de crema, productos lácteos (principalmente quesos) y el jamón sobre todo el cocido o alimentos elaborados con éste.

CLASIFICACION

Las enterotoxinas estafilocócicas son producidas por cepas muy específicas; sin embargo, una de ellas es capaz de sintetizar más de un serotipo de enterotoxinas. Actualmente se diferencian por su actividad serológica no menos de 7 enterotoxinas que se designan A, B, C1, C2, C3, D y E. La enterotoxina del serotipo A es la que con más frecuencia aparece en los brotes de intoxicación alimentaria y le siguen en orden decreciente las de los serotipos C1, B, D y E.

La originalmente descrita enterotoxina F ha sido identificada como la tóxina productora del síndrome de shock tóxico (TSST-1) en mujeres y en ocasiones en hombres. Se trata de una enfermedad multisistémica caracterizada por el comienzo súbito de fiebre, vómitos y diarreas, hipotensión, enrrojecimiento conjuntival, "lengua de fresa" y exantema (con posterior descamación). Investigaciones actuales indican que la producción de TSST-1, elaboradas por cepas de S. aureus, mantienen una relación directa con algunos serotipos toxigénicos que provocan brotes de intoxicación alimentaria, en estudios que se han realizado en cepas aisladas en humanos, alimentos y animales domésticos.1-2

PATOGENICIDAD

Cuando los alimentos contaminados con enterotoxinas estafilocócicas son ingeridos por el hombre, los síntomas se manifiestan bruscamente entre 2 y 6 h después. Aparecen náuseas, vómitos, malestar general, diarreas y en casos graves postración, calambres y shock por caída brusca de la presión arterial.

Los síntomas duran habitualmente menos de 24 h y la enfermedad raramente es fatal, aunque en ocasiones puede ser necesario remplazar la pérdida de líquidos que se producen a consecuencia de los vómitos y las diarreas. Por otra parte, se ha encontrado el crecimiento de cepas estafilocócicas productoras de enterotoxinas en paciente con enterocolitis pseudomembranosa después de un tratamiento con antibióticos de amplio espectro.5 La enfermedad se manifiesta por calambres abdominales, diarreas graves y deshidratación.

La presencia de cepas estafilocócicas enterotoxigénicas resistentes a medicamentos aislados en cultivos puros de estos pacientes, la necrosis intestinal por la secreción de enterotoxinas y ciertas manifestaciones clínicas distinguen la enfermedad de la intoxicación alimentaria.6

Los sitios receptores eméticos para las toxinas que provocan intoxicaciones son las vísceras abdominales, donde el estímulo sensorial llega al centro del vómito por las vías aferentes parasimpáticas (vagales) y simpáticas.

La diarrea inducida por enterotoxinas ha sido atribuida a la disminución de la absorción del agua desde la luz del intestino y a un aumento simultáneo de la secreción de ésta y de sales minerales desde las glándulas intestinales en un mecanismo mediado por 3-5 AMP. Se considera que valores menores de 1,0 m g de enterotoxina en 100 g de alimentos son suficientes para inducir síntomas clínicos en individuos susceptibles.3

METODOS PARA EVALUAR ALIMENTOS PRESUNTIVAMENTE TOXIGENICOS

Los alimentos contaminados suelen tener altos niveles de estafilococos enterotoxigénicos (? 106 UFC/g). La producción de coagulasa y de la desoxirribonucleasa termoestable (termonucleasa) se usa como base para el diagnóstico causal. La detección de esta enzima, que es una proteína globular constituida por polipéptidos de cadena simple, tiene la propiedad de romper la estructura helicoidal del DNA entre las bases purínicas o pirimidínicas y el ácido fosfórico. La presencia de un halo rosado en la superficie de un medio gelosado indica su presencia en el alimento. La termoestabilidad de esta enzima es su única asociación con el crecimiento del microorganismo e indica la posible aparición de las enterotoxinas en los alimentos.4 Bennet5 considera que la producción de esta proteína se puede encontrar con igual frecuencia en cepas enterotoxigénicas y no toxigénicas. Sin embargo, en brotes de intoxicación alimentaria en 13 provincias de Cuba, Bécquer halló un alto porcentaje de positividad (96 %) entre las cepas toxigénicas y la presencia de la enzima, lo cual concuerda con hallazgos de otros investigadores.7,8

METODOS DE OBTENCION Y PURIFICACION DE TOXINAS ESTAFILOCOCICAS

Las primeras investigaciones comenzaron a principios de la década del 60 y se purificaron diferentes serotipos toxigénicos a partir de cepas productoras de enterotoxinas, mediante varias combinaciones de cromatografía de intercambio iónico y filtración sobre gel, las primeras purificaciones empleaban un largo tiempo, y se hacían en 4 ó 5 etapas, pero se obtenía un bajo recobrado.

En estudios realizados por Bécquer et al.9 en la obtención y purificación de la enterotoxina de serotipo B, se emplearon 3 pasos de purificación fundamentados en la utilización de Amberlite IRC-50 (H), carboximetilcelulosa (CM-321) y Sephadex G-75, y se obtuvo un recobrado total del 15 % y un alto grado de pureza. Resultados más alentadores se presentaron posteriormente en el aislamiento y purificación de la enterotoxina E,10 cuando se obtuvieron 89,72 mg de enterotoxina y un recobrado total del 17,67 %.

Se ha logrado purificar toxinas estafilocócicas en 1 y 2 pasos.11 El primer paso utiliza la cromatografía de afinidad con rojo de triazina para la purificación de la enterotoxina A, y el segundo consiste en un intercambio iónico sobre carboximetil celulosa y un enfocamiento cromático para las enterotoxinas de los serotipos A, B y C donde demuestran una pureza de 72 a 92 %, según un densitograma de poliacrilamida.

OBTENCION DE ANTISUEROS

Se han descrito algunos ensayos sobre la obtención de antisueros para las enterotoxinas estafilocócicas. El uso de los métodos inmunológicos depende de la disponibilidad de los antisueros específicos; la mayoría se ha obtenido en conejos, aunque también se utilizan otros animales. La enterotoxina empleada como antígeno debe ser de una alta pureza para minimizar la presencia de reacciones cruzadas con otras toxinas y antígenos.

Inicialmente se usó una larga serie de inoculaciones para inmunizar conejos con distintas dosis inyectables de enterotoxoides seguidas de dosis de toxinas; posteriormente las inoculaciones comenzaron a emplearse en muy pequeñas cantidades, entre 2 y 5 m g, después se incrementaron entre 1 y 4 mg usando diferentes esquemas de inmunización; dos de estos esquemas requirieron muy pequeñas cantidades de toxinas: 167 y 220 m g.12 Para obtener antisueros de distintos serotipos enterotoxigénicos, el esquema de inmunización más utilizado emplea conejos que son inoculados con intervalos de 8 a 10 días, con 5, 10, 25, 50, 100, 250, y 500 m g de enterotoxinas para finalizar con 2 ó 3 inoculaciones de 100 m g; en este esquema se emplean 112 días.13

En estudios realizados por Bécquer et al.,14 donde se emplearon menos de 64 días con un intervalo de 7 días y se inocularon concentraciones más elevadas de toxinas (10, 50, 200, 1 000, 2 000 y 4 000 m g) suspendidas en adyuvante completo de Freunds (CFa), se obtuvieron títulos aceptables de antisueros de 1:16 y 1:32 a las enterotoxinas A y C2 respectivamente, y se ahorró la mitad del tiempo que se empleó para otros esquemas.

METODOS PARA DETECTAR TOXINAS ESTAFILOCOCICAS

La cantidad de toxinas que puede estar presente en un alimento puede ser mínima (50 ng de alimento). No obstante en los alimentos que provocan brotes de intoxicación alimentaria, la presencia de éstas oscila entre 1 y 5 m g/g de alimento.15

La purificación de las toxinas y la demostración de su antigenicidad ha permitido emplear métodos serológicos para la detección de éstas en filtrados de cultivos. Los métodos serológicos utilizados inicialmente fueron la difusión simple (tubo de Oudin); la inmunodifusión radial simple, que involucra la difusión de la toxina dentro de un gel que contiene anticuerpo homólogo obteniéndose un halo de precipitación visible, el cual puede ser usado para cuantificar la toxina; la inmunodifusión radial doble (Ouchterlony), método semicuantitativo que puede detectar toxinas entre 5 y 10 m g/mL; la placa de óptima sensibilidad (OSP), que es usada para pesquisaje de cultivos bacterianos, y el más comúnmente usado, el método de la lámina, que presenta una sensibilidad entre 0,01 y 0,1 m g/mL y solamente requiere 20 mL de muestra.

Para detectar tales niveles de toxinas en alimentos y filtrados de cultivo bacteriano se necesita un período largo en lo referente a la concentración y extracción de los extractos de alimentos.

La electroinmunodifusión y la hemoaglutinación, que presentan una sensibilidad entre 1 y 10 ng, también han sido utilizadas, pero se han observado reacciones no específicas con algunos de los componentes de diversos alimentos.16

Inicialmente en nuestro laboratorio se utilizó un método mediante el cual se aisla la toxina por concentración de la cepa, filtrado de cultivos (técnica de celofán sobre agar) y finalmente se detecta la toxina por difusión en gel.

Estas y otras técnicas han permitido estudiar brotes de intoxicación alimentaria e investigar la procedencia humana de las cepas toxigénicas aisladas mediante pruebas de fagotipificación.6

En la actualidad se ha introducido en nuestro laboratorio un método de análisis que permite detectar las toxinas directamente en los alimentos por métodos bioquímicos e inmunológicos (doble difusión), lo que ha sido revelado en un trabajo denominado Proliferación de Staphylococcus aureus, relación entre su actividad termonucleasa y la producción de enterotoxinas de Bécquer A, et al. (inédito). En esta determinación no hay que concentrar el alimento, la reproducibilidad es mejor y se requiere mucho menor tiempo.

El radioinmunoensayo (RIA) es uno de los métodos novedosos de análisis de enterotoxinas que puede detectar ni-veles entre 1 y 10 ng/g en un tiempo que oscila entre 3 y 4 h, pero requiere de equipos costosos y es peligroso a la salud por la manipulación de elementos radiactivos. La detección de la toxina por el método inmunoenzimático (ELISA), el cual detecta iguales concentraciones con similar consumo de tiempo que el RIA, es el más factible en muchos laboratorios por la multiplicidad de determinaciones que pueden realizarse, aunque en ocasiones presenta algunos inconvenientes en lo referente a los componentes de algunos alimentos, que en ocasiones interfieren y producen pérdidas en lo concerniente a la especificidad y la sensibilidad.

La reversión pasiva de la hemoaglutinación con latex (RPLA) se fundamenta en que partículas de este producto sensibilizadas con antienterotoxinas purificadas pueden aglutinar con la presencia de la enterotoxina homóloga; esta prueba es muy sensible pues detecta cantidades entre 1 y 2 ng/mL y requiere un tiempo de 24 h para su ejecución.17

En la actualidad se utilizan partículas de latex de alta densidad que son capaces de detectar 0,5 ng/mL de toxinas en 3 h.

El DNA recombinante ofrece muchas posibilidades para el desarrollo de nuevas técnicas analíticas con el fin de detectar cualquier microorganismo contaminante de alimentos, por lo que en un futuro próximo probablemente se aplicarán métodos por esta y otras vías18-22 que permitirán un diagnóstico más eficaz y rápido de las enterotoxinas estafilocócicas.

SUMMARY

It is presented a compendium of the classification, pathogenecity, obtainment, purification, methods of analysis, and other aspects of staphylococcal enterotoxins, as well as advances achieved at the international level and, particularly, in Cuba.

Key words: ENTEROTOXINS/isolation and purification; STAPHYLOCOCCAL FOOD POISONING.

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Lic. Armando Bécquer Lombard. Instituto de Nutrición e Higiene de los Alimentos. Infanta No. 1158, municipio Centro Habana, Ciudad de La Habana 10300, Cuba.
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