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Rev Cubana Aliment Nutr 1997;11(2):89-93
Instituto de Nutrición e Higiene de los Alimentos

Staphylococcus aureus, actividad termonucleasa y enterotoxinas en alimentos

Armando Bécquer Lombard,1 Virginia Leyva Castillo,2 César Lara Ortíz3 y Lidia Mota de la Garza4
  1. Licenciado en Bioquímica. Investigador Auxiliar.
  2. Licenciada en Microbiología. Investigadora Agregada.
  3. Técnico en Procesos Biológicos.
  4. Máster en Ciencias. Escuela Nacional de Ciencias Biológicas. Instituto Politécnico Nacional, México, DF.

RESUMEN

Se inocularon 3 tipos de alimentos (embutidos cárnicos, pescados y leche) con diferentes concentraciones de cepas de Staphyloccoccus aureus (FRI-790 y FRI-S6), productoras de enterotoxinas estafilocócica y termonucleasa. Estas sustancias fueron extraídas y detectadas de los alimentos por métodos bioquímicos e inmunológicos. Todas las muestras dieron resultados positivos cuando el conteo de los microorganismos fue ³ 106 ufc/g de alimento.

Descriptores DeCS: MUESTRAS DE ALIMENTOS; STAPHYLOCOCCUS AUREUS/aislamiento & purificación; NUCLEASA MICROCOCICA/análisis; ENTEROTOXINAS/análisis; PRODUCTOS DE LA CARNE/análisis; PRODUCTOS PESQUEROS/análisis; SUSTITUTOS DE LA LECHE MATERNA/análisis.

Las enterotoxinas estafilocócicas constituyen un grupo heterogéneo de proteínas solubles en agua, poseen un peso molecular relativamente bajo que oscila entre 26 000 y 30 000 daltons. Estas toxinas provienen de cepas específicas; sin embargo, una cepa de Staphyloccocus aureus puede sintetizar múltiples serotipos toxigénicos.1 Las enterotoxinas presentan alta termoestabilidad, requieren al menos 30 min a 100oC para ser destruidas. Se conocen 7 serotipos enterotoxigénicos diferentes: A, B, C1, C2 C3, D, E.

Las enterotoxinas A y D son las más frecuentemente asociadas con las intoxicaciones alimentarias, y el tipo B se detecta con mayor regularidad en infecciones intrahospitalarias. La toxina C3 se relaciona química y serológicamente con los serotipos C1 y C2, pero las estructuras difieren en que la reacción con el antisuero heterólogo es ligeramente diferente desde el punto de vista antigénico.

Es importante la detección de las toxinas porque permite:

A su vez la nucleasa termoestable estafilocócica presente en los alimentos es utilizada como una prueba indirecta de la presencia de una abundante proliferación de Staphylococcus aureus, así como de la posible formación de enterotoxinas.

El objetivo de este trabajo es determinar la relación existente entre la proliferación de Staphyloccocus aureus en los alimentos y la detección de la nucleasa termoestable y las enterotoxinas estafilocócicas, mediante métodos directamente aplicados a los alimentos y no por métodos indirectos (cepas estafilocócicas). Esto permitiría emitir un diagnóstico rápido y certero en alimentos contaminados con enterotoxinas estafilocócicas.

MÉTODOS

Cepas: Staphylococus aureus FRI-790, productora de la enterotoxina del serotipo E, y FRI-S6, productora de la enterotoxina B y de la termonucleasa; estas cepas proceden del Food Research Institute, Madison, Wisconsin, EUA.

Patrones de toxinas: Antígenos y antisueros de las toxinas estafilocócicas de los serotipos toxigénicos B y E, procedentes del Food Research Institute.

Medios de cultivo: Agar Baird Parker para la enumeración de los microorganismos, y agar nutriente y medio DNasa-azul de toluidina para la detección final de la termonucleasa.

Muestras de alimentos: Embutidos cárnicos, pescado y leche. Los alimentos sólidos fueron homogeneizados en batidora con igual cantidad de agua destilada por 1 min, después fueron llevados a temperatura de baño de María durante 30 min y enfriados en baño de hielo por 15 min. Posteriormente se diluyeron en 100 mL de agua destilada, se agitaron, se llevaron a pH 6,9 y finalmente se esterilizaron en autoclave a 121oC durante 15 min. Las muestras de leche no fueron sometidas a este proceso, sino se calentaron hasta la ebullición.

Determinación de unidades formadoras de colonia por gramo de alimento (ufc/g): A un cultivo de 18 a 21 h de Staphyloccocus aureus en cuñas de agar nutriente, se le realizó una suspensión en un tubo de ensayo con 10 mL de suero fisiológico estéril hasta obtener la concentración inicial deseada; se utilizó la escala de Mac Farland haciendo diluciones hasta lograr la concentración propicia para inocular al alimento. La concentración microbiana de las diluciones se comprobó mediante la siembra de 0,1 mL de cada una de ellas en la superficie del medio Baird-Parker, incubado a 37oC durante 24 h en cultivo estático a unas muestras y cultivo agitado a otras. Transcurrido el tiempo, se realizaron diluciones de éste y nuevamente se sembraron en la superficie del medio Baird-Parker para conocer la multiplicación que se había producido.

Extracción y detección de la termonucleasa estafilocócica directamente en el alimento: Se aplicó el método de Tatini3 con ligera modificación del tiempo de centrifugación (40 min).

Extracción y detección de la enterotoxina estafilocócica directamente en el alimento: Se aplicó el método de Reiser1 introduciendo cambios de la resina intercambiadora iónica CG-50 por la IRC-50 (H) y el tiempo de centrifugación (50 min), así como la extracción de la toxina y otras proteínas de la membrana de diálisis con NaCl 0,2 M.

RESULTADOS

En las tablas 1 y 2 se presentan las concentraciones iniciales del inóculo para cada uno de los alimentos estudiados y las concentraciones después de la incubación a 37oC entre 18 y 24 h. En todas las muestras las concentraciones microbianas después de la incubación resultaron ³ 106 ufc/g de alimento. Tanto en cultivo estático como agitado, las muestras resultaron positivas en la detección de la enzima y de la toxina.
TABLA 1. Crecimiento de Staphilococcus aureus, cepa FRI-790
 
Alimentos 
CII 
(ufc/g) CA 
CE 
CDI (ufc/g) 
Jamonada especial
1,5 x 10 
 
2,0 x 107 
Jamonada Habana
1,5 x 10 
 
3,0 x 108 
Jamón Visking
1,5 
 
3,6 x 106 
Embutido emitacao
1,5 
 
2,5 x 107 
Mortadella
1,5 x 10 
 
5,0 x 106 
Merluza
1,5 x 10 
 
2,0 x 106 
Merluza
1,5 x 10 
 
4,0 x 106 
Jurel
1,5 x 10 
 
3,8 x 108 
Jurel
1,5 x 10 
 
3,6 x 108 
Chicharro
1,5 x 102 
 
2,7 x 107 
Leche reconstituida
1,5 x 10 
 
4,2 x 106 
Leche reconstituida
1,5 x 102 
 
5,2 x 107 
Leche fresca
1,5 x 10 
 
4,8 x 106 
 
CII: Concentración inicial del inóculo; CA: Cultivo agitado; CE: Cultivo estático; CDI: Concentración después de la incubación.
TABLA 2. Crecimiento de Spahyloccocus aureus, cepa FRI-S6
 
Alimentos 
CII (ufc/g) 
CA 
CE 
CDI (ufc/g) 
Jamonada Especial
3,0 x 10 
 
2,6 x 108 
Jamonada Habana
3,0 x 102 
 
5,0 x 108 
Jamón Visking
1,5 
 
3,0 x 108 
Jamón Visking
1,5 
 
8,0 x 107 
Tilapia
3,0 x 104 
 
> 109 
Tilapia
1,5 
 
1,8 x 108 
Chicharro
1,5 x 10 
 
3,4 x 107 
Jurel
1,5 
 
2,8 x 107 
Leche reconstituida
1,5 x 102 
 
4,2 x 106 
Leche reconstituida
1,5 x 10 
 
3,9 x 107 
Lecha fresca
1,5 
 
2,4 x 106 
 
CII:concentración inicial del inóculo; CA: cultivo agitado; CE: cultivo estático; CDI: concentración después de la incubación.

DISCUSIÓN

En un trabajo realizado,5 se comprobó una estrecha relación entre las cepas que provocaron brotes de intoxicación alimentaria y la presencia de la desoxirribonucleasa termoestable, ya que de las 51 cepas estudiadas, 49 fueron positivas a la prueba de la producción de termonucleasa. Sin embargo, Tranter expresa que la producción de termonucleasa se puede encontrar en cepas toxigénicas y no toxigénicas. No obstante esta aseveración se suele observar la presencia de la enzima en los alimentos involucrados en los brotes, ya sea detectada por medio de la cepa o por métodos aplicados directamente en los alimentos.6-8 En cuanto a la detección de las enterotoxinas en los alimentos para un diagnóstico rápido se aplican diferentes métodos analíticos, como el inmunoenzimático conocido por ELISA, el radioinmunoensayo, la reversión pasiva de la aglutinación con látex (RPLA) y la cromatografía de afinidad entre otros.9,10 Mediante estos métodos se pueden detectar toxinas en menos de 24 h, pero son mucho más costosos del que hemos aplicado en este estudio. El método ELISA tiene múltiples usos después de haber adquirido el equipamiento necesario, pero presenta dificultades en el proceso analítico con algunos de los componentes del extracto de alimento a investigar, al interferir en la reacción bioquímica y afectar la especificidad o la sensibilidad, aunque este inconveniente puede variar de un alimento a otro.11 El método de detección de enterotoxinas aplicado en el presente estudio requiere aproximadamente 72 h para la emisión de un diagnóstico, se pueden detectar entre 0,1 y 0,01mg de enterotoxina por mililitro de cultivos líquidos y extractos de alimentos concentrados.12

Nuestros resultados permiten concluir que la termonucleasa y la enterotoxina estafilocócica pueden ser detectadas en alimentos que contengan concentraciones de microorganismos ³106 ufc/g de alimento. Las extracciones de la enzima y de las toxinas directamente en los alimentos pueden hacerse en laboratorios con menos recursos. El tiempo de ejecución y emisión del correspondiente diagnóstico, comparado con los métodos microbiológicos e inmunológicos actuales en Cuba, permite mejorar la detección de la enzima y de la toxina en nuestro medio.

AGRADECIMIENTOS

A la Empresa de Productos Cárnicos Nueva del Rosario "Tauro", al Combinado Lácteo "La Lechera" y al Puerto Pesquero de La Habana, por habernos facilitado las muestras de productos alimenticios.

SUMMARY

Three types of food (meat products, fish and milk) were inoculated with different concentrations of strains of Staphylococcus aureus (FRI-790 and FRI-S6), which produce staphylococcal enterotoxins and thermonuclease. These substances were extracted from and detected in food by biochemical and immunological methods. All the samples had positive results when the microorganism count was ³106 cfu/g of food.

Subject headings: FOOD SAMPLES; STAPHYLOCOCCUS AUREUS/isolation & purification; MICROCOCCAL NUCLEASE/analysis; ENTEROTOXINS/analysis; MEAT PRODUCTS/analysis; FISH PRODUCTS/analysis; MILK SUBSTITUTES/analysis.

REFERENCIAS BILIOGRÁFICAS

  1. Halpin-Dohnalek I, Mart MEH. Staphylococcus aureus: production of extracellular compounds and behavior in foods. A review. J Food Protect 1989;52:267-82.
  2. Gay JM. Staphylococcal gastroenteritis. En: Modern Food Microbiology. 4 ed. New York: Academic Press, 1992:160.
  3. Tatini SR. Thermonuclease as an indicator of staphylococcal enterotoxine in food. En: Ory RL, ed. Antinutrients and Natural Toxicants in Foods. Westport, CT: Food Nutr Press Inc, 1985:53-75.
  4. Tranter HS, Brehim RD. Production, purification and identification of the staphylococcal enterotoxins. J Appl Bact Symposium 1990; Suppl:109S-22S.
  5. Bécquer LA, Hernández JM, Figueroa R, Grillo M. Enterotoxigenicidad, actividad termonucleasa y fagotipia en cepas de Staphylococcus aureus aisladas de alimentos. Rev Cubana Aliment Nutr 1991;5(2):88-91.
  6. Tatini SR, Cords B, Gramoli J. Screening for staphylococcal enterotoxins in food. Food Technol 1975;30:64-74.
  7. Adesiyun A. Enterotoxigenic of Staphylococcus aureus from anterior nare of dining hall workers. J Food Protect 1986;24:955-62.
  8. Bécquer LA, Leyva V, Lara C. Detección de la enzima desoxirribonucleasa termoestable (termonucleasa) directamente en el alimento. Rev Cubana Aliment Nutr 1996;10:90-3.
  9. Puig de Centorbi O. Toxicología de los alimentos. En: Intoxicación estafilocócica. Buenos Aires: Hemisferio Sur, 1995;98-101.
  10. Bécquer LA, Lara C, Mota L. Importancia de la detección de enterotoxinas estafilocócica. Rev Cubana Aliment Nutr 1996;10:132-7.
  11. Kuo JKS, Silverman GK. Application of enzyme linked immunosorbent assay for the detection of staphylococcal enterotoxins in food. J Food Protect 1980;43:404-4.
  12. Official Methods of Analysis (AOAC). Staphylococcal enterotoxin in food. 15 ed. Arlington, VA: Herrich K, 1990:451-5.
Recibido: 5 de diciembre de 1996. Aprobado: 7 de abril de 1997.

Lic. Armando Bécquer Lombard. Instituto de Nutrición e Higiene de los Alimentos. Infanta No 1158, municipio Centro Habana, Ciudad de La Habana 10300, Cuba.

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