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Instituto Nacional de Angiología y Cirugía Vascular

Efecto de la criopreservación sobre la fibrinólisis en segmentos vasculares de perros

MSc. Ana Ma. Quintela Pena,1 Lic. Luisa Pérez Pérez,2 Dra. Claudina Zaldívar Muñoz3 y Téc. Liliana Salgado Boris4

Resumen

La efectividad de los implantes vasculares criopreservados depende fundamentalmente de lograr que el endotelio vascular se mantenga sano y funcional, por lo que nos propusimos estudiar el efecto de la criopreservación sobre la actividad fibrinolítica en segmentos vasculares de perros. Se estudiaron segmentos vasculares arteriales criopreservados a ­ 20 ºC durante 3, 6 y 12 meses, a los cuales se les determinó la actividad fibrinolítica mediante el uso de placas de agarosa-fibrina utilizando como patrón la uroquinasa con actividad fibrinolítica conocida, expresada en unidades internacionales (UI). En todos los segmentos estudiados se observó la presencia de actividad fibrinolítica, la cual decrece a medida que se alarga el período de criopreservación, si se compara con la actividad fibrinolítica encontrada en ellos antes de haber sido sometidos a la conservación en frío.

Palabras clave: Fibrinólisis, criopreservación, veterinaria.

El endotelio es un órgano con funciones disímiles cuya integridad es sinónimo de salud y está involucrado en la patobiología de diferentes enfermedades como la aterosclerosis, la trombosis y la hipertensión arterial, influyendo además en la inflamación y la homeostasis.

El endotelio vascular se considera un órgano de vital importancia para el organismo humano pues es capaz de sintetizar un gran número de sustancias que intervienen en los mecanismos de coagulación y fibrinólisis, por lo que de su estabilidad y normalidad depende el mantenimiento del equilibrio requerido entre los diferentes procesos que evitan la ocurrencia de mecanismos agresivos para el organismo.

Con vistas a disminuir los efectos adversos de las prótesis sintéticas, se han utilizado los vasos sanguíneos criopreservados obtenidos de cadáveres o de animales, pero los resultados son controversiales,1 ya que el éxito de las prótesis vasculares depende de la presencia de un endotelio sano, activo y funcional, de lo contrario, el endotelio se convierte en una superficie trombogénica que permite la adhesión de las plaquetas en él y la aparición de trastornos en el sistema de la coagulación y la fibrinólisis. Por tal motivo resulta de vital importancia conocer las mejores condiciones para el tratamiento y conservación del endotelio que hagan posible mantener sana la superficie endotelial de las prótesis biológicas.

Por todo lo anteriormente expuesto nos propusimos para el presente trabajo el siguiente objetivo:

Métodos

Obtención y tratamiento de los segmentos vasculares

Se utilizaron segmentos vasculares arteriales obtenidos de perros Beagle, sanos suministrados por el CENPALAB (Centro Nacional para Animales de Laboratorio).

Todo el proceso se llevó a cabo bajo condiciones de esterilidad estricta, así como todas las soluciones de trabajo se encontraban estériles y en una temperatura entre 4 y 10 ºC.

Todos los fragmentos permanecen criopreservados en una solución que contiene solución Collins , dimetilsulfóxido al 33 % y antibiótico , la cual se conserva a ­ 20 ºC en freezer. Se tomaron fragmentos a los 3, 6 y 12 meses de permanecer criopreservados para la determinación de la actividad fibrinolítica, la que fue comparada con la actividad presente en los segmentos antes de congelar.

Antes de la crioconservación se toma un segmento arterial para la determinación de la actividad fibrinolítica inicial mediante placas de agarosa - fibrina que resulta el control.

Determinación de la actividad fibrinolítica de los segmentos arteriales criopreservados

Para la determinación de la actividad fibrinolítica de los segmentos arteriales a los diferentes períodos de criopreservación se prepararon las placas de agarosa - fibrina según una modificación del procedimiento descrito por Klocking.2 Las muestras que presentan actividad fibrinolítica producen áreas de lisis transparentes fácilmente identificables y medibles. Esta actividad se cuantifica utilizando como patrón la uroquinasa con actividad fibrinolítica conocida expresada en unidades internacionales (UI). Se construye una curva patrón en papel semilogarítmico, donde el diámetro de la zona de lisis es directamente proporcional al logaritmo de la actividad fibrinolítica.

Se realizó el análisis estadístico de los resultados empleando el test de Wilcoxon para muestras pareadas para la actividad fibrinolítica.

Resultados

La tabla representa la actividad fibrinolítica existente en los fragmentos criopreservados por diferentes tiempos y el control según el procedimiento realizado en placas de agarosa-fibrina.

Tabla. Actividad fibrinolítica de las muestras estudiadas (placa de agarosa-fibrina correspondiente a la figura [A y B])

Muestra
Tiempo de criopreservación (meses)
No. de observaciones
Unidad de actividad fibrinolítica (X ± DS)
1*
0
10
140,6 ± 4,9
2
3
10
128,11 ± 7,3
3
6
10
93,39 ± 4,77
4
12
10
76,34 ± 4,75
5
18
10
59,93 ± 3,8
6
24
10
30,23 ± 3,7

* La muestra No. 1 corresponde a un fragmento de arteria fresca considerada como control.

En la figura (A y B) se observan las placas de agarosa-fibrina realizadas para la determinación de la actividad fibrinolítica; el segmento arterial fresco, sin criopreservación es el que presenta la mayor actividad, en tanto las muestras analizadas a los 3, 6 y 12 meses de crioconservación mantienen una actividad de la fibrinólisis aceptable y aquellas con un período de criopreservación mayor, muestran una marcada disminución con respecto a la actividad presente en los fragmentos antes de ser conservados en frío.

 

 

Fig. Placa de agarosa-fibrina realizada para la determinación de la actividad fibrinolítica.

 

Discusión

Los síntomas clínicos de la enfermedad arterial periférica son el resultado de un estrechamiento progresivo de las arterias de los miembros inferiores,3 donde la relación coagulación-fibrinólisis se considera actualmente un factor de riesgo. El equilibrio entre estos 2 sistemas de la hemostasia constituye una defensa antitrombogénica, requerimiento esencial para el éxito de una prótesis vascular, fundamentalmente en aquellas de pequeño calibre.

El mecanismo de la fibrinólisis resulta de gran importancia para el mantenimiento de la hemostasia, o lo que es lo mismo, para la protección del organismo contra episodios trombóticos 4 y su desempeño normal asegura en una acción conjunta con otros sistemas plasmáticos, la permeabilidad de los vasos y la fluidez de la sangre circulante; una perturbación de esta actividad del endotelio vascular promueve la activación del mecanismo de la coagulación.5

La causa más frecuente del descenso de la actividad fibrinolítica es un aumento de la concentración del inhibidor del activador del plasminógeno-1 (PAI-1) con la consecuente inhibición de la actividad del activador del plasminógeno (t -PA), colocando al sistema fibrinolítico en una situación deficitaria que puede originar un estado de hipercoagulabilidad. Un aumento en la expresión del PAI - 1 puede corresponderse con una respuesta endotelial patológica, que se manifiesta por una disminución de la liberación del t -PA y de la actividad fibrinolítica.6

La presencia de áreas de lisis en las placas de agarosa-fibrina demuestra la existencia de actividad fibrinolítica en las muestras conservadas en nuestras condiciones por un período no mayor de 12 meses y evidencia que durante este período las células endoteliales se encuentran funcionales y conservan la posibilidad de síntesis del t-PA. La mayor actividad fibrinolítica correspondió al segmento fresco que se empleó como control y disminuye a medida que aumenta el tiempo de criopreservación.

Como se observa el potencial fibrinolítico de las células endoteliales comienza a afectarse a partir de los 12 meses de criopreservación. Esta marcada disminución de la actividad fibrinolítica de los fragmentos arteriales se corresponde con los resultados encontrados en los estudios anatomopatológicos de las muestras, donde se aprecia el inicio de ligeras alteraciones en la pared del vaso a partir de este tiempo de conservación en frío.

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en el presente trabajo podemos concluir diciendo que las arterias criopreservadas a - 20 ºC hasta 12 meses mantienen actividad fibrinolítica, la cual disminuye a medida que avanza el período de crioconservación.

 

Summary

The effectiveness of criopreserved vascular grafts mainly depends on keeping a healthy and functional vascular endothelium, so we intended to study the effect of criopreservation in the fibrinolytic activity in vascular segments from dogs. We analyzed vascular arterial segments criopreserved at - 20 °C for 3, 6 and 12 months. The use of agarose-fibrin plates and of urokinase, as a pattern, with known fibrinolytic activity expressed in international units allowed us to determine the fibrinolytic activity, which was observed in all the studied segments. It decreases as the criopreservation period extends if compared with the fibrinolytic activity found in such segments before having been subjected to criopreservation.

Key words: Fibrinolysis, criopreservation, veterinary.

Referencias bibliográficas

  1. Lehalle B, Geschier C, Fleve G, Stoltz JF. Early rupture and degeneration of criopreserved arterial allografts. J Vasc Surg 1997;25(4):751-2.
  2. Klocking HP, Bock G, Drawert J, Hinsenbeock KP, Kaiser B, Sedlarik V. Uber die freisetzung von plasminogenaktivatoren. Folia Haematol Leipzig 1976;103(3):404-7.
  3. Philipp CS, Cisar LA, Kim HC, Wilson AC, Sardi P, Kostis JB. Association of hemostatic factors with peripheral vascular disease. Am Heart J 1997;134:978-84.
  4. Rouvier J, Scazziota A. Factores y marcadores de riesgo de trombosis. Rev Iberoamer Tromb Hemostasia 1994;7:192-209.
  5. Schneider DJ, Ricci MA, Taatjes DJ, Baumann PQ, Reese JC, Leavitt BJ. Changes in arterial expression of fibrinolytic system proteins in atherogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997;17:3294-3301.
  6. Steingrimur S, Haudenschild CC, Lawrence DA. Beyond fibrinolysis: The role of Plasminogen Activator Inhibitor-1 and Vitronectin in vascular wound healing. Trends Cardiovasc Med 1998;8:175-80.

Recibido: 25 de noviembre de 2003. Aprobado: 22 de enero de 2004.
MSc. Ana Ma. Quintela Pena. Instituto Nacional de Angiología y Cirugía Vascular. Calzada del Cerro # 1551, municipio Cerro, Ciudad de La Habana, Cuba. CP 12000.

1 Master en Biotecnología. Investigadora Auxiliar.
2 Investigadora Auxiliar.
3 Doctora en Ciencias. Profesora Titular. Facultad de Biología, Universidad de La Habana.
4 Técnica de Laboratorio Clínico.

 

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