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Instituto Nacional de Angiología y Cirugía Vascular


Fibronectina plasmática total: método de determinación y valores en pacientes con macroangiopatía diabética


Lic. Miriam Mahía Vilas,1 Dr. José Ignacio Fernández Montequín,2 Lic. Luisa Pérez Pérez,1 Lic. Luisa Estela Ramos Morales,1 Dr. Arquímedes Díaz Batista,3 Lic. Ma. Eugenia Triana Mantilla4 y Téc. Lina García Lara5

Resumen

Se determinaron los valores de fibronectina plasmática (Fn p) total en pacientes con macroangiopatía diabética; para lograrlo se estandarizó una técnica de inmunodifusión radial simple, en la que se utilizó un antisuero antifibronectina (anti Fn) obtenido en carnero. Fueron estudiados 30 individuos sanos como grupo control y como grupo de estudio, 35 pacientes con macroangiopatía diabética con y sin manifestaciones de pie diabético, cuyos valores fueron de 278±8,2 µg/mL y 295±11,6 µg/mL respectivamente. Los valores obtenidos de Fn p total para el grupo control fueron de 327±22 µg/mL. Al comparar los valores de ambos grupos se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas (p<0,05). El coeficiente de variación intra e interensayo para los grupos fue menor de 10 %. Se concluyó que los niveles de Fn p total en los pacientes diabéticos se encuentran disminuidos, debido a que suponemos que esta migre y se adhiera en la superficie de las lesiones clínicas que acompañan a la mayoría de estos pacientes, razón por la cual disminuyen los niveles de Fn p circulantes.

Palabras clave: Angiopatía diabética, fibronectina, inmunodifusión.

La fibronectina es una glicoproteína plasmática multifuncional de la matriz extracelular que desempeña un importante papel en la adhesión celular.1-2 Esta proteína tiene un modelo complejo de empalme al RNA mensajero que conduce a la expresión de diferentes isoformas. Posee un dominio que se encuentra expresado durante el desarrollo de la cicatrización de heridas que promueve la adhesión celular en un tipo celular específico.3-4

La fibronectina (Fn) como proteína de adhesión celular tiene efectos biológicos específicos sobre las células, por ejemplo, su deposición temporal sobre la matriz extracelular es importante para varios procesos tanto normales como patológicos en la formación, mantenimiento y remodelación del tejido, formación de trombos y formación de tumores y metástasis.5

La Fn y sus receptores denominados integrinas regulan diferentes propiedades y funciones celulares como polaridad, migración y organización del citoesqueleto y trasmiten señales que influyen en la expresión genética, proliferación y apoptosis.6

Son múltiples las situaciones clínicas en las cuales los niveles de esta proteína pueden estar alterados.7 Altos niveles de Fn plasmática (Fn p) han sido observados en enfermedades inflamatorias, por el contrario, en shock, quemados, septicemia, infecciones abdominales y tumores malignos, los niveles de esta proteína en plasma se encuentran disminuidos.8 En estos casos se ha visto que el grado de disminución de los niveles de Fn plasmática se correlaciona bien con la extensión y el pronóstico de la enfermedad.

La diabetes mellitus es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en diferentes países y se ha probado que los diabéticos sufren más complicaciones, sobre todo vasculares, si se comparan con una población no diabética. Las lesiones de los pies o el llamado pie diabético es una de las complicaciones que constituye un problema médico, social y económico; y por lo general, aparece en edades avanzadas y sus secuelas más graves son las amputaciones.9

El objetivo del presente estudio fue estandarizar un método de inmunoprecitación para la cuantificación de Fn plasmática total y además conocer las concentraciones de esta proteína en pacientes con macroangiopatía diabética teniendo en cuenta la presencia de manifestaciones clínicas de los miembros inferiores.

Métodos

El estudio consistió en el montaje y estandarización de una técnica para la determinación cuantitativa de los niveles de Fn plasmática total mediante una técnica de inmunodifusión radial simple, utilizando un antisuero policlonal en carnero anti Fn humana, producido por el Laboratorio de Producción del INACV.

Con estos fines fue utilizado un grupo control de 30 individuos sanos de los 2 sexos, procedentes del Banco de Sangre del Hospital Clinicoquirúrgico "Dr. Salvador Allende". El rango de edades de este grupo control se encontraba entre 21 y 57 años (X= 44).

Una vez estandarizado el método fueron estudiados 35 pacientes con macroangiopatía diabética atendidos en el INACV. Los pacientes estudiados se encontraban clasificados como diabéticos tipo 2 o no insulinodependientes, pertenecían a los dos sexos y tenían entre 55 y 75 años (X= 65).

Los pacientes fueron divididos para su estudio en 2 grupos:

A los 3 grupos incluidos en el estudio se les realizó la determinación de Fn plasmática total, un estudio del control glicémico y las pruebas de hipersensibilidad retardada (PHR).

Procesamiento de las muestras

Se tomaron muestras de sangre de 5 mL de cada paciente y cada sujeto del grupo control, las cuales contenían EDTA a 0,02 mol/L como anticoagulante y aprotinina 100 000 KIU/L para la determinación de los niveles de Fn plasmática total. La sangre fue centrifugada y el plasma almacenado en alícuotas a -20 °C hasta su uso.

Determinación en plasma de Fn total

La inmunodifusión radial es una reacción de inmunoprecitación en un medio gelificado que permite determinar sin dilución, las proteínas específicas del plasma. Para ello se depositaron volúmenes iguales de las muestras a determinar y plasmas de referencia en pocillos calibrados y recortados en un gel que contenía el antisuero policlonal específico, en este caso anti Fn plasmática humana en carnero titulado 1:32, suministrado por el Laboratorio de Producción del INACV. Durante su difusión después de 48 horas, la Fn formó con el antisuero anillos de precipitación alrededor de cada pocillo, cuyos diámetros variaban con la concentración. En la medición se utilizó una regleta bioMérieux.

El diámetro de difusión es proporcional a la concentración del antígeno, en este caso Fn plasmática total.

Para la estandarización de la técnica fueron utilizados 3 plasmas estándar comerciales de 150, 250 y 350 µg/mL (Behring, Lot No. A 047015 B) y un plasma control (Behring, Lot No. 047015), todos con concentraciones conocidas de Fn plasmática, para establecer una curva de calibración. Los resultados fueron expresados en µg/mL. Todas las muestras fueron analizadas por duplicado.

Pruebas de hipersensibilidad retardada

Se realizaron al inyectar los siguientes antígenos en la piel de cada paciente: tuberculina PPD-RT 23, candidina y tricofitina, ambas diluidas 1:100 y estreptoquinasa 500 U/mL. Después de 48 horas de realizada la prueba se pudieron encontrar 2 tipos de respuestas:

Esta prueba solo fue realizada a los 2 grupos de pacientes.

Ensayo del control glicémico

El control glicémico fue determinado por el método de la glucosa oxidasa de la casa comercial Boehringer Mannheim. Los resultados se expresaron en mmol/L.

Resultados

La tabla 1 refleja los resultados obtenidos para los parámetros estudiados. Puede observarse que los valores de Fn plasmática total en los pacientes son menores que cuando se comparan con los valores del grupo control. Sin embargo, los valores de la proteína se encuentran más disminuidos en aquellos pacientes con manifestaciones clínicas presentes.

De acuerdo con estos resultados se decidió realizar un análisis de varianza para conocer si existían diferencias entre los grupos y se encontró una p<0,05 al comparar el grupo 1 y el control. Por otra parte, a pesar de observar niveles de Fn disminuidos en el grupo 2, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas al comparar el grupo 2 con el grupo control y entre los 2 grupos de pacientes.

Tabla 1. Media y desviación estándar de los parámetros estudiados

Grupos
N
Edad/años (X)
Fn p total (µg/mL)
Glicemia (X±DS)
1
20
55-75
(X=65)
278±8,2*
7,5±2,6*
2
15
48-72
(X=60)
295±11,6
6,2±1,3
Control
30
21-57
(X=44)
327±13,0
4,8±1,2

Grupo 1: Pacientes con manifestaciones clínicas de pie diabético.
Grupo 2: Pacientes sin manifestaciones clínicas de pie diabético.
* P<0,05

A diferencia de la Fn, en el control glicémico se observa que los 2 grupos de pacientes tienen valores más elevados que el grupo control, pero estas diferencias son más notables en el grupo 1.

Al aplicar el análisis de varianza se encontró una p<0,05 al comparar el grupo 1 y el control. Por el contrario, al comparar los grupos 1 vs. 2 y 2 vs. control, no se encontraron diferencias estadísticas. Esto nos indica que hay diferencias en el control glicémico de los pacientes aquejados de macroangiopatía con manifestaciones clínicas de pie diabético y sin ellas.

Precisión del ensayo

La reproducibilidad de la Fn p total por inmunodifusión radial fue determinada por 15 repeticiones de 3 estándares y 6 muestras de plasma (2 de cada grupo).

El coeficiente de variación (CV) para las determinaciones inter e intraensayo tanto de los estándares como de las muestras fue menor del 10 %.

El CV intraensayo para los 3 estándares y las 6 muestras varió entre 2,0 y 7,0 % y el interensayo entre 4,0 y 8,0 %. Los CV intra e interensayo para la Fn fueron 1,8 y 4,0 % respectivamente.

Posteriormente se procedió a realizar un análisis de correlación de Pearson entre la Fn y el tiempo de evolución de la enfermedad (fig.), para lo cual se encontró un coeficiente de correlación de r = - 0,7044 (p<0,01). Esto nos indica que a mayor tiempo de evolución los niveles de Fn p disminuyen.

Fig. Estudio de correlación entre la Fn p total y el tiempo de evolución de la diabetes.

En el estudio de las PHR, los resultados para los grupos de pacientes pueden observarse en la tabla 2. De un total de 20 pacientes con lesiones fueron reactivos 7 (35 %) y 13 anérgicos (65 %). En cambio, para el grupo sin lesiones, 9 fueron reactivos (60 %) y 6 anérgicos (40 %). Al aplicar una prueba t Student para comparar los grupos, se obtuvo una diferencia significativa (p<0,05, T = 6,8). Según nuestros resultados la mayoría de los pacientes con lesiones en el pie son anérgicos a las PHR, a diferencia de los pacientes sin lesiones, cuyas pruebas resultan reactivas.

Tabla 2. Comportamiento de las PHR en los pacientes con y sin lesiones

PHR
Grupo 1
No./%
Grupo 2
No./%
Total
No./%
Reactivo
7(35 %)
9 (60 %)
16 (45.7 %)
Anérgico
13 (65 %) *
6 (40 %)
19 (54.2 %)
Total
20 (100 %)
15 (100 %)
35 (100 %)

*T=6,8 (p<0,05)

Discusión

Aunque se encuentran pocos trabajos en la literatura médica que aborden el tema de la Fn en el paciente diabético, no todos concuerdan en los resultados.11 Estas diferencias pueden responder a diferentes causas como por ejemplo, la diversidad de técnicas empleadas en las determinaciones (turbidimétricas, nefelométricas, inmunoenzimáticas, etc.). Hay que tener en cuenta que algunas determinan Fn total y otras Fn funcional.12

Otra causa es el inadecuado control de la glicemia de los pacientes diabéticos13 que sabemos que interfiere de forma activa sobre su mecanismo de defensa inmunológico y por consiguiente en la presencia de lesiones vasculares. Esta última es vital, pues la Fn es importante en los procesos curativos además de promover la adherencia de las plaquetas al tejido dañado y la migración y adherencia de neutrófilos.

Una pobre cicatrización de las heridas ha sido atribuida a una isquemia local en pacientes diabéticos, debido a una disminución en la formación de colágeno, el cual es inhibido por niveles elevados de glucosa, lo que resulta en una disminución del contenido de colágeno intersticial en las heridas. Una curación deficiente o retardada de las heridas es típica de los pacientes diabéticos.

Suponemos que estos procesos están acompañados por un incremento en la concentración de Fn local como resultado de una aumentada producción o síntesis de la molécula, por tal razón, la Fn puede ser considerada como moduladora de la función fagocítica y de la respuesta del hospedero a la infección. Además se sugiere que una concentración incrementada de glucosa en las heridas empeora los procesos de curación normal. Se plantea que la Fn presente en los queratocitos de piel normal no expresa receptores, pero sí cuando responde a una lesión tisular, por lo que estas células utilizan Fn para migrar hacia una herida. Esta puede ser la causa de que se encuentren niveles más bajos en pacientes con lesiones en comparación con los que no manifiestan lesiones.

En trabajos anteriores se pudo comprobar que los pacientes diabéticos anérgicos son más susceptibles a desarrollar procesos sépticos, lo que concuerda con este estudio.14-15

Summary

Total plasma fibrinectin (p Fn) values were determined in patients with diabetic macroangiopathy. To this end, a simple radial immunodiffusion technique was standardized, which employed an antifibronectin antiserum obtained from a lamb. 30 healthy individuals formed the control group and 35 patients with diabetic macroangiopathy with and without diabetic foot manifestations made up the study group. The p Fn values were 327±22 µg/mL for the control group and 278±8.2 µg/mL and 295±11.6 µg/mL for the study group respectively. Statistically significant differences were observed when comparing values of both groups (p< 0.05). The variation coefficient intra-and inter-assays for the groups was under 10 %. It was concluded that total plasma fibronectin levels reduce in diabetic patients because we think that fibronectin migrates and adheres to the surfaces of clinical lesions suffered by most of these patients. This is the reason why the circulating p Fn levels decrease.

Key words: Diabetic angiopathy, fibronectin, immunodiffusion.

Referencias bibliográficas

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  14. Mahía VM, Lima SB, Fernández MJ, García LL, García RM. Pruebas de hipersensibilidad retardada. Su utilidad en pacientes con angiopatía diabética. Rev Cubana Angiol Cir Vasc 2002; 3:32-7.
  15. Mahía VM, Fernández MJ, Pérez PL, Ramos ML, Díaz BA, García LL. Inmunidad celular y estados de anergia. Comportamiento en pacientes con pie diabético. Rev Cubana Angiol Cir Vasc 2002; 3:47-53.


Recibido: 12 de noviembre de 2003. Aprobado: 5 de diciembre de 2003.
Lic. Miriam Mahía Vilas. Instituto Nacional de Angiología y Cirugía Vascular.
Calzada del Cerro # 1551, municipio Cerro, Ciudad de La Habana, Cuba.
CP 12000 E-mail: mmahia@infomed.sld.cu

1 Licenciada en Bioquímica. Investigadora Auxiliar.
2 Especialista de II Grado en Angiología y Cirugía Vascular.
3 Doctor en Ciencias. Especialista de II Grado en Bioquímica. Investigador Titular.
4 Licenciada en Bioquímica. Investigadora Titular.
5 Técnica de Laboratorio Clínico.

 

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