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Anuario Toxicología 2001;1(1):40-7

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Centro Nacional para la producción de animales de laboratorio

Estudio de toxicidad subcrónica dérmica del factor de crecimiento epidérmico humano-recombinante

Lic. Ana M. Bada Barro,1 Dr. Francisco O. González Menció,2 Dra. María E. Arteaga Pérez,3 Dra. Avelina C. León Goñi,4 Dra. Bárbara González Navarro5 y Lic. Juana Hernández Estrada6

Resumen

Se realizó un estudio de 90 días en ratas Fischer 344/Cenp. Se crearon 4 grupos: control y las dosis factor de crecimiento epidérmico de 5, 100 y 1 000 mg/kg de peso corporal La aplicación dérmica y la observación de los animales se realizó diariamente. Semanalmente se midió el consumo de agua y alimento y el peso corporal. Al finalizar el estudio todos los animales fueron sacrificados. Se tomaron muestras para determinaciones de hematología y de química sanguínea. El estudio de anatomía patológica contó con la observación macroscópica de los animales, así como con el estudio del peso corporal posmortem y de los órganos parenquimatosos. Se fijaron muestras de órganos y tejidos en formalina y se realizó estudio histológico. No ocurrieron muertes, ni manifestaciones clínicas de interés. En los estudios de laboratorio clínico y anatomía patológica no se encontraron diferencias que evidencien un efecto tóxico. La aplicación del factor de crecimiento epidérmico no produjo efectos tóxicos.

DeCS: FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDERMICO/administración & dosificación; TESTS DE TOXICIDAD/ /métodos; TESTS DE QUIMICA CLINICA/ métodos; RATAS CONSANGUINEAS F 344; ADMINISTRACION CUTANEA.

El factor de crecimiento epidérmico humano recombinante (FCEhum-rec), es un polipéptido de 52 aminoácidos, dispuestos en una cadena sencilla con 3 puentes disulfuros.1-3 Todos los miembros de la familia de los factores de crecimiento epidérmico, están involucrados en los procesos de promoción del desarrollo y crecimiento en los mamíferos.3 Las acciones de éste sobre la cicatrización en la piel, han conducido a que se planteen importantes aplicaciones clínicas,5 que han sido extendidas a otros tejidos más delicados como la córnea humana.6 Se ha realizado el tratamiento de las quemaduras en general con una reducción significativa en el tiempo y la calidad de la cicatrización de los procesos quirúrgicos degenerativos, que requieran cicatrización o regeneración tisular, como en úlceras o lesiones por radioepidermitis y radiodermitis, en úlceras por extravasación de citostáticos y en úlceras por insuficiencia circulatoria.


Métodos

Sustancia de ensayo

En el estudio fue utilizada la crema de FCEhum-rec, suministrada por el Grupo de Formulaciones de la División de Ensayos Clínicos y Preclínicos del Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología, (CIGB). La preparación de la crema se hizo siguiendo los procedimientos de rutina para esta forma farmacéutica, utilizando en la formulación varios excipientes (ácido esteárico, carbonato de potasio anhidro, preservos y glicerina). La determinación del contenido de FCE en la crema se hizo mediante ELISA.


Animales

Se utilizaron 80 ratas Fischer 344 (F344/Cenp), de 4 a 5 sem de edad y peso de 146 g ± 6,9 (hembras) y 201,7 g ± 14,4 (machos), provenientes de la División de Roedores Genotobióticos del Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio. Se formaron grupos de 20 animales, 10 por sexo. Las condiciones del estudio y los procedimientos de rutina estuvieron de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio. Los animales se adaptaron al ambiente de la sala por un período de 26 días, previo al comienzo del estudio. Fueron alojados de forma individual en cajas T4 (Techniplast) y se mantuvieron en ambiente controlado de temperatura (24 ± 2 °C) y humedad relativa (60 ± 5 %), con fotoperíodo de 12 h luz/oscuridad, y más de 12 cambios de aire/hora. Se suministró dieta comercial pelletizada 1 002 EMO, (ALYco®, CENPALAB) y agua potable esterilizada a 121 °C, ad libitum.


Diseño experimental

Las ratas fueron tratadas diariamente durante 13 sem con la crema hidrófila de FCE en las dosis de 5, 100 y 1 000 mg/kg de peso corporal. La aplicación dérmica de la crema se realizó en un área rasurada de 2 cm2 en el dorso de los animales. Los animales del grupo control recibieron ungüento hidrófilo en el mismo volumen que los tratados. Los animales fueron observados diariamente para detectar signos clínicos de toxicidad o muerte. El peso corporal, el consumo de agua y el alimento se determinaron con una frecuencia semanal. Los exámenes de química sanguínea y hematología se realizaron al finalizar el estudio al total de los animales, usando muestras de sangre extraídas de la vena femoral de los animales anestesiados con éter dietílico.
Se analizaron los siguientes parámetros de hematología: hemoglobina, hematócrito, leucocitos totales y el conteo diferencial (linfocitos, neutrófilos, monocitos y eosinófilos), y conteo de reticulocitos.

En química sanguínea se determinó glucosa, calcio, urea, creatinina, bilirrubina, proteínas totales, aspartato amino transferasa, alanina amino transferasa, fosfatasa alcalina, sodio y potasio.

Al finalizar el estudio todos los animales fueron sacrificados por dislocación cer-vical, previa anestesia con éter dietílico y desangrado por la vena femoral.

Se practicó necropsia al total de los animales y se les realizó examen de la superficie externa del cuerpo, de todos los orificios y cavidades (craneal, toráxica y abdominal) y de sus contenidos.

Se tomó el peso corporal posmorten y el de corazón, pulmones, riñones, hígado, bazo, adrenales, timo, testículo izquierdo, ovario izquierdo y encéfalo.

Se fijaron en formalina al 10 % muestras de corazón, aorta, pulmón, bazo, timo, ganglios mesentéricos y cervical, páncreas, esófago, tráquea, estómago, duodeno, yeyuno, íleon, vejiga, ciego, colon, glándulas salivales, hígado, testículos, epidídimos, ovarios, úteros, cérvix, vagina, próstata, vesículas seminales, hipófisis, adrenales, tiroides, cerebro, músculo estriado voluntario, nervio ciático, lengua, glándula mamaria, ojos, glándula de Harderian, riñones, sitio de inoculación, y en caso de hallar lesiones macroscópicas, también fueron incluidas de forma independiente tomando zonas de la lesión. Del sitio de inoculación se tomaron muestras de piel tratada y muestras que incluian piel tratada y no tratada aledañas.

Las muestras fijadas fueron procesadas en parafina, seccionadas y teñidas con hematoxilina-eosina para observarlas al microscopio. Todas las láminas de los grupos control y tratados con la dosis alta fueron observadas al microscopio.


Análisis estadístico

Los resultados son presentados como media (X) ± desviación estándar (DE). Las diferencias estadísticas entre el grupo control y los grupos tratados se determinó por un análisis de varianza (One-way ANOVA) o por su similar no paramétrico Kruskal-Wallis- (Statistical Package Scientific System, SPSS for Windows, Released 5.0.1, 1992). Cuando se obtuvo diferencias, se aplicó el test de comparaciones múltiples de Duncan. La normalidad se determinó por el test de Kolmogorov-Smirnov y la homogenidad de varianzas mediante el test de Levene; en los casos en que no se cumplieron estas condiciones se transformó la variable. Se trabajó para un nivel de significación de p < 0,05.


Resultados

No ocurrieron muertes durante el estudio. En la mayoría de los animales se detectaron secreciones cristalinas en los ojos (uno o ambos). En varios casos la secreción se presentó conjuntamente con secreciones nasales. No se observaron signos clínicos de toxicidad que parecieran estar relacionados con la administración de la sustancia de ensayo. El análisis estadístico de los pesos demostró que en las hembras no había diferencias significativas entre grupos. Sin embargo, en los machos se obtuvo diferencias significativas entre el grupo control y los grupos dosis media y dosis alta, presentando estos menor peso. Al verificar el comportamiento a lo largo del estudio, se comprobó que esta diferencia se manifestó desde la primera semana cuando los animales se distribuyeron al azar (tablas 1 y 2).

 

El consumo de alimentos (tablas 3 y 4) presentó diferencias significativas entre grupos en ambos sexos. El consumo de agua no se analizó estadísticamente debido a que hubo fluctuaciones producto del goteo de los biberones.

 


Los resultados de hematología (tabla 5) reflejaron una diferencia significativa entre grupos para los leucocitos y eosinófilos en los machos, y en los monocitos en las hembras. En los resultados de química sanguínea (tabla 6), se observó diferencias entre grupos para los parámetros creatinina, calcio, alanina amino transferasa, potasio, proteínas totales y bilirrubina en las hembras y sodio en los machos. El peso posmorten (tabla 7) manifestó diferencias entre grupos para los machos, coincidiendo con los resultados del análisis del peso vivo. El peso absoluto (tablas 8 y 9) de ovarios y encéfalo mostró diferencias entre grupos; en los machos los pesos absolutos del bazo y del corazón presentaron diferencias que se corresponden con las diferencias del peso corporal. El peso relativo del bazo presentó diferencias en los machos (tablas 10 y 11).

 

Discusión

Los resultados obtenidos en el presente estudio muestran que el FCE administrado por vía dérmica a las ratas en dosis de 5 a 1 000 mg/kg de PC, no produjo cambios en la salud general y la conducta de los animales, ni en la ganancia de peso, consumo de alimentos y de agua. Se observó secreciones cristalinas en los ojos de las ratas (aproximadamente en el 90 %). Estos síntomas son típicos en presencia de Mycoplasma pulmonis, pero el examen microscópico no arrojó presencia del germen.
Los resultados de hematología y química sanguínea, a pesar de que en algunos parámetros hubo diferencias significativas, se encuentran dentro de los rangos normales para la especie y línea establecidos, tomando X ± 1,5 DE.

La piel se observó saludable y se comportó de igual manera en el grupo control que en los grupos tratados. No se hallaron diferencias microscópicas entre la zona de aplicación del FCE y el área aledaña no tratada. En el hígado se apreciaron cuerpos de inclusión intracito-plasmáticos acidófilos, tanto en animales tratados como controles, no presentando relación con la aplicación del FCE. En conclusión, se comprobó que la aplicación subcrónica dérmica de la crema FCE en ratas F344/Cenp, no produjo muerte ni signos tóxicos demostrables en ninguno de los 3 niveles de dosis empleados.

Referencias bibliográficas

  1. Paget GE, Thomson R. Toxicology. Vol. 1. Standard Operating Procedures. Inveresk Research International Ltd. IRI. Edimburg. MPT Press Ltd. International Medical Publisher. Lancaster, England. 1980.
  2. Prigent SA, Lemoine NR. The type 1 (EGFR-related) family of growth factor receptors and their ligands. Progress in Growth Factor Research 1992;4:1-24.
  3. Van Setten GB, Tervo K, Virtanen Y, Tarkkanen DR, Tervo T. Immuno-histochemical demonstration of epidermal growth factor in the lacrimal and submandibular glands of rats. Acta Ophthalmol (Copenh); 1992;2-3:477-80.
  4. Martí U, Burwen SJ, Jones AL. Biological effects of epidermal growth factor, with emphasis on the gastrointestinal tract and liver: an update. Hepatology 1989;9(1):126-38.
  5. Fallon JH, Annis CM, Gentry LE, Twardzik DR, Loughlin SE. Localization of cells containing transforming growth factor-alpha precursor inmunoreactivity in the basal ganglia of the adult rat brain. Growth factors 1990;2(2-3):241-50.

Recibido: 29 de mayo del 2001. Aprobado: 30 de junio del 2001.
Lic. Ana M. Bada Barro. Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio. Finca Tirabeque, carretera del cacahual km 2 ½, Bejucal, La Habana, Cuba.

 

1 Licenciada en Farmacia. Investigadora Agregada.
2 Doctor en Ciencias Médicas. Investigador Auxiliar.
3 Especialista Principal del Proyecto.
4 Especialista en Hematología.
5 Especialista en Anatomía Patológica.
6 Licenciada en Química. Especialista en Química Sanguínea.

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