Estandarización de un sistema inmunoenzimático elisa para cuantificar lipoproteína (A) humana

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Rev Cubana End 1999;10(1):50-6

Instituto Nacional de Endocrinología

Estandarización de un sistema inmunoenzimático elisa para cuantificar lipoproteína (A) humana

Lic. Giovanna Pereira Acosta,¹ Lic. Arturo Reyes Durán,² Lic. Armando Seuc Jo³ y Téc. Mireya Andreu Arce⁴

Resumen

Se desarrolló una metodología para cuantificar Lp (a) humana por un ELISA tipo sandwich. Se observó que el sistema desarrollado y específicamente el antisuero policlonal antiapo (a) de conejo no presentó reacción cruzada con el plasminógeno, el límite de detección del sistema fue de 2 mg/dL. En el estudio de precisión, se comprobó que los coeficientes de variación para los pooles estudiados fueron en la repetibilidad (n = 10) 4,30; 5,63; 3,97 % y en la reproducibilidad (n = 12) 5,29; 6,44; 7,49 %. Según los análisis estadísticos realizados se concluyó que la sensibilidad y la especificidad del sistema desarrollado fueron superiores al 90 %, aunque se observó que nuestro sistema subestima el valor de la concentración de la Lp (a) en 2,64 mg/dL con respecto al sistema de referencia utilizado, esta diferencia no fue significativa desde el punto de vista clínico.

Descriptores DeCS: TEST DE ELISA; LIPOPROTEINA (A); SUEROS INMUNES.

La lipoproteína (a) representa una clase de partícula lipoproteica definida por la presencia de apolipoproteína (a), glicoproteína que está unida a la apolipoproteína B100 a través del puente disulfuro.^1-3

La cuantificación de Lp (a) ha adquirido gran relevancia en años recientes ya que se han observado concentraciones elevadas de ella en pacientes con infarto del miocardio, enfermedad arterial coronaria demostrada angiográficamente, aterosclerosis carótida y apoplejía y en el marco de los esfuerzos dirigidos a identificar la presencia silente de la aterosclerosis y de los factores de riesgo capaces de predecir su desarrollo.^4-6

Se han empleado diversos inmunoensayos para determinar la Lp (a) que requieren de anticuerpos específicos a apo (a) que no tengan reacción cruzada con el plasminógeno y que reconozcan todas las isoformas de apo (a).^7,8 En nuestro laboratorio se produjeron los reactivos primarios como el antisuero policlonal antiapo (a) de conejo, y el conjugado antiLDL de carnero que permitió desarrollar un ELISA de Lp (a) tipo sandwich.^9-11

En el presente trabajo se exponen los resultados obtenidos en el desarrollo de la metodología para la estandarización del ELISA de Lp (a). Aspiramos a que estos esfuerzos contribuyan a facilitar la determinación de Lp (a) con fines asistenciales e investigativos en los laboratorios y servicios clínicos de nuestra red de salud.

Métodos

Reactivos

Antisuero policlonal antiapo (a) de conejo, producido en nuestro laboratorio.
Conjugado policlonal anti-LDL de carnero, producido en nuestro laboratorio.
Tampón de recubrimiento Tris-NaCl-NaN₃ 10 nM pH 8,6.
Tampón de lavado 5 x (NaCl 40 g; KCl 1 g; Na₂HPO₄ x 2H₂O 7,12 g; KH₂PO₄ 1 g; tween 12,5 g; timerosal 0,5 g) pH 6,3.
Tampón de ensayo (PBS) 10 x pH 7,2-7,4.

Sustrato: H₂O bidestilada 5 mL, tampón sustrato 5 mL, 1,2 Phenylendiamin (OPD) 4 mg.

Estándar de referencia de Lp (a) humana (68 mg/dL). IMMUNO AG.
Control humano de Lp (a) de la IMMUNO AG.
ELISA de Lp (a) comercial INNOTEST Lp (a) de la INNOGENETICS.
Placas de poliestireno de 96 pozos de la NUNC IMMUNO MODULE.

Equipos

Sistema ultramicroanalítico (SUMA), modelo 121, CUBA.

Método analítico

Empleamos como método de referencia para cuantificar Lp (a), INNOTEST comercializado por la firma INNOGENETICS, Bélgica.
El ELISA de Lp (a) tipo sandwich que desarrollamos, reproduce las condiciones descritas para el método de referencia, con el uso de reactivos de producción local.

Pasos de este procedimiento

Recubrimos la placa de 96 pozos de poliestireno con 100 mL de antisuero antiapo (a) en tampón de recubrimiento a una concentración de 2 mg/mL, lo incubamos por 3 h a 37 ° C en cámara húmeda. Preparamos la curva estándar por diluciones sucesivas del estándar con tampón PBS, los puntos de concentraciones obtenidos fueron (2,1; 4,3; 8; 17; 34 y 68 ng/mL). Prediluímos 1/4 000 las muestras y el control comercial.

Lavamos las placas con 200 mL de tampón de lavado en 3 ocasiones. Pipeteamos 10 mL de estándares, control y muestras prediluidas en PBS según la distribución previa de la placa, completamos la dilución de los mismos por adición de 90 mL de tampón PBS, agitamos suavemente 1 min para garantizar una buena homogeneización, incubamos 2 h a 37 ° C en cámara húmeda, lavamos 5 veces la placa, adicionamos en cada pocillo, 100 mL del conjugado anti-LDL a una dilución de 1/7 000 en tampón de lavado e incubamos 1 h a 37 ° C en cámara húmeda. Lavamos 5 veces la placa y esperamos 2 min en el último, adicionamos 100 mL de sustrato preparado casi al instante de ser usado, esperamos 30 min en la oscuridad, detuvimos la reacción con 20 mL de H₂SO₄ 2,5 M en cada pocillo. Leímos los valores de absorbancia a 492 nm en espectrofotómetro fluorímetro SUMA.

Hicimos los cálculos mediante el programa ELISA versión III para análisis y control de laboratorio del CIGB de Camagüey del año 1991.

Determinación de la actividad cruzada con plasminógeno y límite de detección

A consecuencias de la similitud estructural que existe entre la apo (a) y el plasminógeno cabe estimar que podría ocurrir una reacción cruzada del antiapo (a) con el plasminógeno durante el desarrollo del ELISA, por tanto seleccionamos 3 valores de concentración de la curva patrón (2,1; 34 y 68 ng/100 mL) y les adicionamos concentraciones crecientes de plasminógeno en un rango suprafisiológico (> 0,2 mg/mL), distribuidas en 0,25; 0,50; 0,75; y 1 mg/dL y desarrollamos el ELISA. Para el límite de detección utilizamos un estándar comercial de Lp (a) (IMMUNO AG) de concentración de 18 mg/dL, 6 diluciones consecutivas que abarcaron el rango de 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; y 3 mg/dL. Seguidamente desarrollamos el ELISA tipo sandwich.

Hicimos la validación analítica para el método desarrollado, mediante los estudios de calibración, repetibilidad, reproducibilidad, sensibilidad, especificidad.
Comparamos nuestros resultados con el método de referencia, según el procedimiento propuesto por Bland y Altman (1986)¹² y Pollock y otros (1992)¹³ el cual está reconocido como una de las alternativas adecuadas (ver alternativas en Linemt (1993)¹⁴ y Smith y otros (1980),¹⁵ en contraposición al tradicional, pero inadecuado procedimiento de calcular y analizar la recta de regresión mínima cuadrática para ambos métodos (ver Combleet y Gochman, 1979).¹⁶
Todos los análisis estadísticos los hicimos empleando el paquete estadístico SPSSPC versión 3,1.

Resultados

Comprobación del funcionamiento de nuestro sistema ELISA

El resultado obtenido del enfrentamiento de ambos sistemas se puede apreciar en la figura 1. La curva identificada como Kit en prueba es el resultado de promediar las curvas estándares correspondientes a 12 corridas.

FIG. 1. Comportamiento de ambos sistemas.

Determinación de la actividad cruzada con el plasminógeno y el límite de detección

La figura 2 refleja la distribución de las lecturas una vez obtenidos los valores de absorbancia para las 3 concentraciones estándares de Lp (a) a las diferentes concentraciones suprafisiológicas de plasminógeno, en los 3 casos es lineal.

FIG. 2. Prueba de actividad cruzada con el plasminógeno.

Observamos que solamente a concentraciones iguales o mayores de 2 mg/dL, el sistema ofrecía información correcta, por tanto la concentración mínima de Lp (a) en una muestra capaz de ser detectada por nuestro sistema es precisamente la que se menciona anteriormente.

Precisión

La tabla 1 muestra los resultados del estudio de precisión del sistema evaluado mediante 3 muestras cuyas concentraciones de Lp (a) (predeterminadas por el ELISA de Lp (a) comercial) cubrieron el rango bajo, medio y alto de la curva estándar. TABLA 1. Estudio de precisión del sistema

	Repetibilidad (n = 10)			Reproducibilidad (n = 12)
	Alto	Medio	Bajo	Alto	Medio	Bajo
Media	61,66	39,43	4,78	63,69	42,84	4,64
DE	2,61	2,22	0,19	3,37	2,76	0,35
CV (%)	4,23	5,63	3,7	5,29	6,44	7,49

DE: Desviación estándar. CV: Coeficiente de variación.

Sensibilidad, especificidad y valores predictivos

A partir del procesamiento de 50 muestras de sueros tomadas al azar, a las cuales les calculamos la concentración de Lp (a) por el sistema nuestro y por el de referencia comercial INNOTEST, determinamos la sensibilidad, la especificidad y los valores predictivos positivo y negativo; para comparar ambos métodos analíticos, obtuvimos los 4 indicadores para un valor de corte (considerados entre valores normales y de riesgo) de concentración (30 mg/dL), usualmente reportada en la literatura como valor límite de riesgo de desarrollar enfermedades cardiovasculares. La tabla 2 hace referencia a estos resultados: riesgo SI [Lp(a)]>30 mg/dL. TABLA 2. Criterios de riesgo con nuestro sistema y con el kit comercial

Kit-Nuestro ®	Normal	Riesgo	Total
Kit-Comercial ¯
Normal	31 (n₁₁)	1(n₂₃)	32
Riesgo	1 (n₁₂)	17 (n₂₂)	18
Total	32 (n₁₁ + n₁₂)	18 (n₂₁ + n₂₂)	50

Sensibilidad del 94 %, o sea, de cada 100 muestras patológicas procesadas en nuestro sistema, se reportan como normales 6 que verdaderamente no lo son.
Especificidad del 97 %, esto representa que cada 100 muestras normales procesadas en nuestro sistema, se reportan como patológicas 3 que en realidad no lo son.
Valor predictivo positivo del 94 %, o sea, de cada 100 casos clasificados como patológicos por nuestro sistema, 6 de ellos serían normales si los analizara por el kit belga.
Valor predictivo negativo del 97 %, esto implica que de cada 100 casos reportados como normales por nuestro sistema, 3 de ellos serían patológicos si los analizara por el kit de referencia belga.

Las fórmulas empleadas fueron:

                       n₂₂Sensibilidad      = ---------- x 100 % 

(falsos negativos)   n₂₁ + n₂₂                       n₁₁Especificidad     = ---------- x 100 %

(falsos positivos)   n₁₁ + n₁₂

Comparación de ambos métodos analíticos

El promedio de las diferencias de las concentraciones calculadas por ambos métodos para cada una de las 50 muestras fue de 2,64 mg/dL y el error estándar 0,6 mg/dL, esto significa que nuestro sistema, como promedio, subestima la concentración reportada por el kit comercial en 2,64 mg/dL, como muestra la figura 3. Los resultados obtenidos en el análisis adicional realizado, tomando como concentración real la media aritmética, no variaron de manera importante al compararlos con los reportados cuando empleamos como concentración real, la media ponderada.

FIG. 3. Diferencia entre los métodos, comercial-patio vs. Lp (a).

Discusión

Resulta notable el incremento experimentado en los años recientes en el número de investigaciones básicas, clínicas y epidemiológicas en el campo de las lipoproteínas, particularmente en relación con la lipoproteína (a). La disponibilidad de métodos estandarizados de cuantificación de esta lipoproteína se reconoce hoy en día como una necesidad, pues a pesar de los esfuerzos llevados a cabo en los últimos años por diversas agencias y comités internacionales, éste no es un asunto resuelto totalmente. En nuestro país son pocos los laboratorios clínicos que cuentan con métodos y medios para cuantificar Lp (a), de ahí nuestro interés en desarrollar métodos y producir reactivos primarios, que hagan posible la accesibilidad a la determinación de Lp (a) con fines asistenciales e investigativos. Los resultados que presentamos avalan la calidad analítica de los métodos desarrollados que emplean reactivos propios.

En la curva estándar observamos un desplazamiento proporcional de la densidad óptica a las diferentes concentraciones, y los valores de concentración calculados por ambos sistemas para los controles empleados mostraron una buena aproximación, además de encontrarse dentro del rango de confianza reportado por el fabricante.

Al evaluar la actividad cruzada con el plasminógeno obtuvimos resultados alentadores ya que a las concentraciones a las que lo trabajamos no hubo interferencia que afectara la unión de la Lp (a) al antisuero, de ahí, que a un mismo valor de concentración del estándar los valores de absorbancia se mantuvieran constantes a pesar de incrementarse los valores de concentración del plasminógeno hasta niveles suprafisiológicos. Por tanto, como esperábamos un comportamiento lineal y efectivamente lo logramos, es posible concluir que nuestro sistema y específicamente el antisuero antiapo (a) no presenta reacción cruzada con el plasminógeno que interfiera en la determinación de la Lp (a) en suero.

Los valores en cuanto a la repetibilidad y reproducibilidad, para el coeficiente de variación, según lo reportado por la literatura, deben ser menores del 10 %, por lo tanto, nuestros resultados concuerdan con este planteamiento y son similares a los trabajos de Taddie¹⁰ y Labeur.¹¹

Los análisis estadísticos realizados permitieron concluir que la sensibilidad y la especificidad del sistema desarrollado son superiores al 90 %, lo cual concuerda con lo reportado en la literatura para este tipo de ensayo; aunque nuestro sistema subestima el valor de la concentración de la Lp (a) en 2,64 mg/dL con respecto al sistema de referencia utilizado, esta diferencia no es significativa desde el punto de vista clínico.

En nuestro país son pocos los laboratorios que cuentan con métodos y medios para cuantificar Lp (a), de ahí nuestro interés en desarrollar métodos y producir reactivos primarios que hagan posible determinar esta lipoproteína con fines asistenciales e investigativos. Los resultados obtenidos en esta etapa de trabajo son alentadores, pues logramos estandarizar el ELISA de Lp (a) en nuestro laboratorio con reactivos propios, lo cual permite disminuir grandemente el costo de esta determinación en divisas.

Summary

A methodology to quantitate human Lp(a) was developed by a sandwich ELISA. It was observed that the developed system and specifically the anti apo (a) polyclonal antiserum of rabbit did not present cross reaction with the plasminogen. The limit of detection of the system was 2 mg/dL. In the accuracy study it was determined that the variation coefficients for th studied pools were in the repetition (n = 10) 4.30; 5.63; 3.97 %, and in the reproducibility (n = 12) 5.29; 6.44; 7.49 %. According to the statistical analyses made, it was concluded that the sensitivity and specificity of the developed system were over 90 %, although it was observed that our system understimates the concentration value of Lp(a) in 2.64 mg/dL as regards the reference system used. This difference was not significant from the clinical point of view.

Subject headings: ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY; LIPO-PROTEIN (A); IMMUNE SERA.

Referencias Bibliográficas

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Smith DS. Linear regression analysis by Denning's a method. Clin Chem 1980;26(7):1105-9.
Combleet PJ, Gochman N. Incorrect least-squares regression coefficients in method comparison analysis. Clin Chem 1979;25(3):432-8.

Recibido: 15 de diciembre de 1998. Aprobado: 29 de enero de 1999.
Lic. Giovanna Pereira Acosta. Instituto Nacional de Endocrinología, Zapata y D, El Vedado, Ciudad de La Habana, Cuba. CP 10400.

¹ Licenciada en Bioquímica. Investigadora Agregada.
² Licenciado en Bioquímica.
³ Doctor en Ciencias Matemáticas.
⁴ Técnica de Laboratorio Clínico.

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