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Instituto Nacional de Endocrinología. Centro de Atención al Diabético
Aislamiento de productos finales de la glucosilación avanzada por
cromatografía de afinidad
Dr. Manuel Ayra Rivas,1 Lic. Oscar Díaz
Horta2 y Lic. Alexis Rendón Herrera2
RESUMEN
Se describió un procedimiento para obtener productos finales de
la glucosilación avanzada a partir de una mezcla de albúmina
que había sido glucosilada e incubada a 37 °C en condiciones
de esterilidad, oscuridad y en presencia de glucosa por 6 sem. Se empleó
la cromatografía de afinidad con matriz de lisozima para aislar
los péptidos glucosilados que eluyeron con hidróxido de sodio
0,1 N. Se determinó la densidad óptica a 280 nm de cada fracción.
Se observó que las fracciones eluidas de la mezcla de albúmina
y glucosa, describieron una curva con un área mayor que la mezcla
de albúmina sin glucosa, este hecho coincidió con lo planteado
en otros trabajos. Se concluyó que la cromatografía de afinidad
con matriz de lisozima es un método eficaz para aislar los productos
finales de la glucosilación avanzada. Se planteó que estos
productos podrían emplearse para elaborar métodos inmunoquímicos
de detección en la sangre, tejidos u otros líquidos corporales.
Las lecturas de las densidades ópticas fueron útiles para
demostrar los péptidos glucosilados que eluyeron.
Descriptores DeCS: PRODUCTOS FINALES DE GLUCOSILACION AVANZADA/aislamiento
y purificación; CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD/métodos.
Los productos finales de la glucosilación avanzada (PFGA) constituyen
un grupo de moléculas con alto peso molecular, que se forman en
las proteínas expuestas a altas concentraciones de glucosa por mucho
tiempo.1
Estos compuestos forman puentes intercatenarios entre las proteínas
que afectan sus funciones biológicas.2 Diversos estudios
han tratado de demostrar el papel mediador de los PFGA en los efectos nocivos
de la glucosa en la diabetes a largo plazo para evitar con su control el
desarrollo de complicaciones propias de la enfermedad.3
Los métodos más efectivos empleados en la actualidad para
la detección de PFGA son los inmunoquímicos, entre ellos
los ensayos inmunoenzimáticos para la detección en líquidos
corporales4 y las inmunofluorescencias indirectas para estudios
de tejidos.5
Éstos emplean anticuerpos policlonales obtenidos en conejos inmunizados
con PFGA de proteínas como ribonucleasa, colágena y albúmina
bovina. En todos estos casos se necesita el aislamiento de los péptidos
que contienen a los PFGA. El método que se ha reportado como el
más adecuado es la cromatografía de afinidad con matriz de
lisozima (CAML) que se basa en la afinidad que tiene esta enzima para unirse
a los PFGA.6
Éste ha sido empleado, tanto como un método de aislamiento
y purificación como para detectar y cuantificar PFGA en líquidos
corporales.
Con este trabajo nos propusimos evaluar la capacidad de la CAML, para
aislar PFGA de mezclas de albúmina incubada con glucosa (AG) y sin
ella (ASG) que contengan PFGA presentes o no, respectivamente, con el propósito
de valorar su utilidad en la producción del inmunógeno y
en los métodos de testaje de anticuerpos anti PFGA.
MÉTODOS
Mezcla albúmina-glucosa
Incubamos a 37 °C, en condiciones de esterilidad y oscuridad, una mezcla
de 0,5 M de glucosa y 50 g/mL de albúmina bovina en tampón
fosfato 0,2 M (PBS) a pH 7,4 y otra que sólo contenía albúmina
bovina en PBS por 6 sem.
Terminado este tiempo dializamos 3 veces ambas mezclas en PBS, en proporciones
de 1/200 toda la noche y hallamos la concentración final de proteínas
por el método del biuret. Determinamos además la fluorescencia
en las longitudes de onda de 370/440 nm en espectrofluorímetro Shimatzu
modelo RF-540. Verificamos el cambio de coloración de las mezclas
en todo el tiempo que duró el experimento.
Columna de afinidad con matriz de lisozima
Realizamos el acoplamiento de la lisozima en el gel Sepharosa 4B activado
con CNBr (Pharmacia, LKB) según el método descrito por sus
fabricantes.8 El rendimiento del acoplamiento fue del 90 %.
Montamos una columna de 2 mL de volumen de cama que se estabilizó
con PBS.
Corrida cromatográfica
Depositamos en la superficie del gel 0,5 mL de la mezcla AG a 6 mg/mL en
PBS. Hicimos lavados extensivos de la matriz con PBS en flujo regulado
a 0,5 mL/min. Recogimos fracciones de 0,5 mL en colector de fracciones
FRAC-100.
Empleamos NaOH 0,1 N como tampón de elución para los PFGA.
A cada fracción le determinamos la absorvancia a 280 nm en espectrofotómetro
Spectronic 21 D contra blanco PBS. Graficamos los valores obtenidos en
una computadora empleando el programa graficador HG.
RESULTADOS
Obtención de los PFGA
Para obtener PFGA, incubamos una mezcla de AG y otra de ASG como control.
En la misma se evidenció la cinética de la formación
por la presencia de los PFGA fluorescentes en las longitudes de onda de
370/440 nm y el cambio de coloración de las mezclas. La mezcla de
AG mostró una coloración amarillo-marrón y su fluorescencia
fue mayor que la mezcla ASG (tabla).
TABLA. Fluorescencia (en unidades arbitrarias) y coloración
de las mezclas incubadas 6 sem a 37 ° C,
en oscuridad y esterilidad
| |
Al inicio
|
6 sem después
|
| Mezclas |
Color
|
Fluorescencia
|
Color
|
Fluorescencia
|
| Albúmina con glucosa |
Incolora
|
27,0
|
Amarillo-marrón
|
346,8
|
| Albúmina sin glucosa |
Incolora
|
26,0
|
Incolora
|
46,25
|
Cromatografía de afinidad con matriz de lisozima
Montamos las mezclas de AG y ASG en la CAML, por separado. A las fracciones
eluidas les determinamos la densidad óptica a 280 nm. Las fracciones
eluidas con PBS de la mezcla AG mostraron menores densidades ópticas
que las mezclas ASG y las fracciones siguientes que se eluyeron con NaOH
0,1 N de la mezcla AG mostraron un área bajo la curva mayor que
la mezcla ASG (fig.).
FIG. Cromatograma de las mezclas AG y ANG a 280 nm.
DISCUSIÓN
La importancia de la determinación de los PFGA en las complicaciones
de la DM es aceptada en la actualidad por la mayoría de los autores.
La CAML se ha estudiado para el aislamiento de los PFGA del suero y como
método analítico para su cuantificación. En nuestro
trabajo no analizamos la presencia de los PFGA en cada fracción
que eluyó de la columna por carecer de PFGA marcado con isótopos
radiactivos, sin embargo, las densidades ópticas a 280 nm de las
fracciones describieron una figura muy similar a las presentadas en otros
estudios que emplearon PFGA marcados con iodo radiactivo.6,9
La presencia de estos picos nos indica que nuestra columna CAML, fue capaz
de retener los péptidos que contenían PFGA. Estos péptidos-PFGA
pudieran ser empleados en la elaboración de inmunógenos para
producir anticuerpos policlonales de los métodos inmunoquímicos
(ELISA ó RIA) de detección. La detección de PFGA en
suero, plasma y tejidos del paciente diabético pudiera servirnos
como un indicador del estado metabólico a largo plazo y como un
predictor de complicaciones de la diabetes. Esto puede ayudar a tomar conductas
terapéuticas para su prevención. Igualmente las CAML, pudieran
servirnos para el análisis de alimentos y de tabaco que contienen
PFGA para regular su consumo en los diabéticos.
En conclusión, la CAML es un método eficaz para aislar
los PFGA de una mezcla de albúmina glucosilada que puede servir
para elaborar métodos inmunoquímicos de detección.
Con la lectura de las densidades ópticas a 280 nm se puede demostrar
la presencia de los péptidos con PFGA que eluyen con NaOH 0,1 N
y con el empleo de patrones con concentración conocida la CAML pudiera
emplearse para cuantificar PFGA en mezclas de proteínas, en suero
humano y en alimentos.
SUMMARY
A procedure to obtain advanced glycosylation end products starting from
a mix of albumin that had been glycated and incubated at 37 ºC under
conditions of sterility, darkness and in the presence of glucose for 6
weeks was described. Affinity chromatography with a matrix of lysozime
was used to isolate the glycated peptides that eluted with sodium hydroxide
0,1 N. It was determined the optic density of each fraction at 280 nm.
It was observed that eluted fractions of the mix of albumin and glucose
described a curve with a higher area than the mix of albumin without glucose.
This fact coincided with what is stated in other papers. It was concluded
that affinity chromatography with a matrix of lysozime is an efficient
method to isolate the advanced glycosylation end products. It was suggested
that these products could be used to prepare immunochemical methods of
detection in blood, tissues or other body fluids. The readings of the optic
densities were useful to show the glycated peptides that eluted.
Subject headings: GLYCOSYLATION END PRODUCTS, ADVANCED/isolation
and purification; CHROMATOGRAPHY, AFFINITY/methods.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
-
Vlassara H. Recent progress in advanced glycation end products and diabetic
complication. Diabetes 1997;46(Suppl 2):s19-s25.
-
Burssenwenger P, Moore I, Curphey T. Relation of glycemic control collagen-linked
advanced glycation end products in type 1 diabetes. Diabetes Care 1993;16:689-94.
-
Cohen MP, Ziyadeh FN. Role of Amadori-modified nonenzimatically glycated
serum proteins in the pathogenesis of diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol
1996;7:183-90.
-
Makita Z, Vlassara H, Cerami A, Bukala R. Immunochemical detection of glycosilation
end products in vivo. J Biol Chem 1992;267:5133-8.
-
Bucala R, Vlassara H. Advanced glycosylation end products in diabetic renal
and vascular disease. Am J Kidney Dis 1995;26:895-8.
-
Mitsuhashi T, Li Y, Fishbane S, Vlassara H. Depletion of reactive advanced
glycation end products from diabetic uremic sera using a lysozime-linked
matriz. J Clin Invest 1997;100:847-54.
-
Wrobel K, Garay-Sevilla M, Nava L, Malacara J. Novel analytical approach
to monitoring advanced glycosilation end products in human serum with on
line spectrophotometric and spectrofluorimetric detection in a flow system.
Clin Chem 1997;43:1563-9.
-
Kohn J, Wilchek M. A colorimetric method for monitoring activation of Sepharose
by cyanogen bromide. Biochem Biophys Res Commun 1978;84:7-14.
-
Korchinski T, Jiang-He C, Mitsuhashi T, Bucala R, Liu C, Bueting C, et
al. Orally absorbed reactive glycation products (glycotoxins): environmental
risk factor in diabetic nephropathy. Proc Natl Acad Sci USA 1997;94:6474-9.
Recibido: 7 de enero de 2000. Aprobado: 9 de marzo de 2000.
Dr. Manuel Ayra Rivas. Instituto Nacional de Endocrinología.
Centro de Atención al Diabético, Calle 17 No. 505 entre D
y E, El Vedado, Ciudad de La Habana, Cuba.
1 Especialista de I Grado en Laboratorio
Clínico. Jefe de la Sección de Laboratorio del Centro de
Atención al Diabético.
2 Licenciado en Bioquímica. Departamento de Inmunología
de la Diabetes. Instituto Nacional de Endocrinología.