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Rev Cubana Endocrinol 2000;11(2):78-89
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Instituto Nacional de Endocrinología

Caracterización bioquímica de prolactina de diferentes especies

Lic. Víctor Cabrera Oliva1, Lic. Julio C. Rodríguez García,1 Lic. Isabel Méndez,1 Lic. Fernando Larrea Gallo1 y Lic. Alina Chapé Puerta1

RESUMEN

Se utilizaron diferentes técnicas para determinar las características bioquímicas de las preparaciones de prolactina (Prl) de origen hipofisario con preparados que se utilizan en centros de investigaciones para el desarrollo de sistemas in vivo e in vitro, bioanálisis, radioinmunoanálisis y análisis inmunoenzimáticos. Los preparados se analizaron por electroforesis bajo condiciones reductoras (SDS-PAGE), electrotransferencia e inmunodetección, enfoque isoeléctrico, cromatografía líquida de alta presión (HPLC), y capacidad de unión a receptores microsomales (RRA). Se encontró que en las Prl (s) porcina (pPrl), ovina (oPrl) y humana (hPrl) existen proporciones significativas de la forma glucosilada (30-40%), no así en la Prl bovina (bPrl) y en la de rata (rPrl). Se comprobó que es posible detectar impurezas o mezclas de las diferentes formas moleculares de la Prl presentes en estos preparados hipofisarios utilizando HPLC. El análisis por enfoque isoeléctrico de las Prl (s) hipofisarias de diferentes especies reveló que en la bPrl existen 4 isoformas de carga eléctrica, la oPrl y la hPrl están compuestas por 3 isoformas mientras que la rPrl y la pPrl presentan 1 y 2 isoformas, respectivamente. Aún se desconoce cuál podría ser el significado fisiológico de las isoformas de carga eléctrica en la Prl hipofisaria de diferentes especies. Según los resultados obtenidos a partir de las curvas de desplazamiento y de las gráficas de Scatchard, se encontró que existen diferencias entre las constantes de disociación (Kd) y la capacidad de unión de las prolactinas a los receptores microsomales. Finalmente es necesario conocer con mayor exactitud las propiedades bioquímicas, inmunológicas y biológicas de los preparados de las prolactinas que son utilizadas en diferentes estudios tanto in vivo como in vitro, porque en esas residen las funciones biológicas de la hormona. Se confirmó y se amplió la heterogeneidad estructural de la Prl en diferentes especies de mamíferos, que dan lugar a la existencia de diferentes variantes moleculares de la hormona y a la diversidad de funciones que ejerce. Se comprobó la necesidad de desarrollar nuevos métodos para el estudio del significado biológico de la heterogeneidad estructural de la Prl y de obtener las diferentes variantes moleculares de la Prl con un alto grado de pureza, que permitan establecer nuevos métodos cuantitativos, útiles para ser aplicados en estudios clínicos y bioquímicos. La adecuada comprensión de las modificaciones estructurales de las Prl y de sus consecuencias biológicas, permitirán establecer los mecanismos de síntesis y secreción de esta hormona, incluyendo sus propiedades multifuncionales.

Descriptores DeCS: PROLACTINA/química; IN VITRO; ELECTROFORESIS/métodos; ENFOQUE ISOELECTRICO/métodos; CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA PRESION/métodos.
 

Actualmente se considera que la prolactina (Prl) es la hormona más versátil en términos de sus actividades biológica e inmunológica y que el número de funciones en las que participa es superior al resto de las hormonas hipofisarias en su conjunto. Se han informado más de 150 acciones diferentes de la Prl.1 Es una hormona proteínica con peso molecular (pm) aproxi-mado de 23 kDa y aunque durante muchos años se consideró que era producida exclusivamente por las células somatotropas o mamosomatotropas,2 investigaciones realizadas durante las últimas décadas han demostrado la producción ectópica de Prl, así como la expresión de su mensajero (mARN) en una gran variedad de órganos, células y tejidos. La fuente más rica de la Prl extrahipofisaria es la placenta,3 pero también es producida por el endometrio,4 miometrio5 y por el tejido cerebral.6 En estudios más recientes se ha confirmado que células del sistema inmunológico son capaces de producir factores con actividad prolactínica 7 y se ha demostrado su expresión génica en los timocitos,8 células linfoblastoides de tipo B 9 y en los linfocitos T.10,11

La secuencia proteínica o del ADN complementario (cDNA) ha permitido conocer y establecer la estructura primaria de la Prl de más de 25 especies.12 A este respecto, en la mayoría de las especies estudiadas, la estructura de la hormona está compuesta por 197-199 residuos de aminoácidos, con 3 puentes disulfuros intracatenarios localizados entre las posiciones 4-11,58-174 y 191-199. La Prl de primates y la humana,13 ovina,14 porcina,15 equina16 y la de dromedarios,17 contienen un sitio único de glucosilación situado en la posición 31 correspondiente al residuo de asparagina, a diferencia de los cocodrilos y los lagartos,18 en los que se encuentra ubicado en la posición 60. Al compararse las secuencias aminoacídicas de la Prl contenida en diferentes especies, se observa un grado variable de homología, lo cual refleja en gran parte, el orden de las interacciones filogenéticas. Entre las especies se han conservado alrededor de 32 residuos aminoacídicos,19 los que aparecen formando celdas localizadas en 4 regiones distintas de la molécula y situadas en las posiciones 18-32,58-72,83-98 y 160-199. Se considera que éstas celdas forman dominios en la molécula de la Prl para la unión específica a receptores y que son importantes para la regulación de los múltiples efectos biológicos descritos para ésta hormona.12

La Prl se caracteriza por su marcado polimorfismo molecular.20,21 Dentro de éste se incluye, en algunas especies, la existencia de variantes genéticas de la hormona.22 En la mayoría de las especies estudiadas, la Prl se encuentra constituida por varias formas moleculares determinadas por transformaciones postraduccionales. Dentro de éstas las más comunes son aquéllas derivadas de procesos como la glucosilación,23 fosforilación,24 sulfatación,25 desaminación,26 y enzimáticas.27

Durante los últimos años, nuestro laboratorio ha estado interesado en la búsqueda de las posibles relaciones que existen entre la estructura molecular de la Prl y la secreción inadecuada de la hormona como causa de infertilidad. Al mismo tiempo hemos utilizado modelos in vitro con la finalidad de determinar el significado de las diferentes formas moleculares de la Prl sobre la regulación de algunas funciones celulares y metabólicas como son la esteroidogénesis de las células de ovarios y testículos, maduración folicular, espermatogénesis y otras que resultan de interés en la reproducción humana. Por otra parte, hemos desarrollado diferentes procedimientos analíticos para determinar las actividades biológicas e inmunológicas de la Prl, en estas investigaciones se utilizan, por razones de costos, preparaciones provenientes de diferentes especies, con un grado de pureza similar al descrito para la Prl hipofisaria humana.

El objetivo fundamental de la presente investigación fue caracterizar preparados de la Prl de diferentes especies y que son ampliamente utilizadas en estudios in vivo e in vitro, a través de electroforesis en geles poliacrilamida, enfoque isoeléctrico, cromatografia líquida de alta presión (HPLC), incluyendo estudios de unión a receptores obtenidos de membranas microsomales (RRA) de hígados de ratas gestantes.

MÉTODOS

Reactivos

Utilizamos acrilamida y bisacrilamida de calidad analítica (British Drug House, BDH, Poole, Inglaterra), persulfato de amonio, TEMED, Glicina, Tris HCI y SDS de calidad analítica (Merck Damstadt, Alemania), anfolinas de rango de 3,5-10 (LKB, Suecia). Durante el desarrollo del trabajo empleamos otros reactivos de calidad analítica o superior.

Preparados hormonales analizados

Los siguientes preparados de Prl de origen hipofisario fueron suministrados por The National Hormone and Pituitary Program, the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, the National Institute of Child Health and Human Development y the U.S. Department of Agriculture de los Estados Unidos: bPrl USDA-bPrl-B-1 (AFP-5300), rPrl NIDDK-rPrl-RP-3 (AFP-4459B),(hPrl) NIDDK-hPrl-B-1 (AFP-8982C),pPrl USDA-pPrl-B-1 (AFP-5300),oPrl NIAMDD-oPrl-14.

Electroforesis de los distintos tipos de Prl hipofisaria en presencia de sulfato dodecílico de sodio SDS-PAGE) y condiciones reductoras. Identificación por electrotransferencia, inmunotinción y autorradiografía

Disolvimos los diferentes preparados de la Prl de origen hipofisario en la solución para muestras de Laemmil 28 y las calentamos durante 5 min a 95 °C.

Sometimos las muestras a electroforesis en geles de poliacrilamida al 12,5 % en presencia de SDS al 1 % y 5 % de b -mercaptoetanol de acuerdo con el método descrito previamente.28 Determinamos los pesos moleculares (pm) a través de una curva con proteínas de pm conocido y los analizamos bajo las mismas condiciones electroforéticas arriba señaladas.

Transferimos las Prl separadas por electroforesis en presencia de SDS a membranas de nitrocelulosa (NTC) en solución amortiguadora de SDS-PAGE que contenía metanol (20 %) de acuerdo con el método descrito por Tobwin y otros.29 Bloqueamos las membranas de NTC durante toda la noche a 4 °C con leche descremada al 5 % en solución amortiguadora de tris/fosfatos salina 0,01 M,pH 7,4 (TFS). Posterior al lavado con la solución TFS descrita anteriormente suplementada con Tween-20 al 1 % (TFS-Tween), incubamos las membranas durante 2 h a temperatura ambiente con suero anti-hPrl diluido 1:200 en solución TFS-Tween. Después de la incubación, lavamos las membranas con la solución TFS y las tratamos durante 2 h a 4 °C con 200 000 cpm/mL de proteína A marcada con I125 según el método descrito por Thorell y Johannson. 30 Después de eliminar el exceso de radiactividad mediante lavados con solución TFS-Tween, secamos las membranas y visualizamos los inmunocomplejos por exposición autorradiográfica durante 72 h a-70 °C y revelado de acuerdo con la técnica de rutina.

Determinación del punto isoeléctrico (pi) de los diferentes preparados de Prl

Analizamos los pi(s) de los preparados de Prl(s) hipofisarias de diferentes especies por enfoque isoelétrico en geles de poliacrilamida a 0,5 % que contenían anfolitas en un rango de pH 3,5-10 de acuerdo con la metodología recomendada por el fabricante.31 Al finalizar, los geles fueron fijados en una solución de ácido tricloroacético al 50 % y teñidos con azul de coomasie al 0,4 %. Analizamos las bandas producidas por cada una de las Prl(s) hipofisarias en un densitómetro láser de barrido (LKB, Suecia). Determinamos los valores de pi(s) y los comparamos contra un patrón de referencia comercial (SERVA, Feinbichemica, Suiza) analizado bajo las mismas condiciones.

Determinación de los patrones de elución de la Prl hipófisaria de diferentes especies por cromatografía líquida de alta presión (HPLC)

Diluimos la Prl hipofisaria obtenida de diferentes especies en una solución amortiguadora de fosfato (PBS 0.1M; pH 7,4) a una concentración de 5 m g/mL. Cromatografiamos alicuotas (20 m L) de esta solución en una columna TSK-2 000 (Tokyo, Japón) y la equilibramos con PBS a un flujo de 0,5 mL/min. Se obtuvieron los tiempos de retención de las distintas muestras analizadas de manera continua a 280 nm.

Determinación de la capacidad de unión de la Prl hipofisaria de diferentes especies a receptores microsomales del hígado de la rata

Realizamos este análisis de acuerdo con la metodología descrita por Posner y Kelly.32 Obtuvimos las membranas microsomales por centrifugación diferencial.

RESULTADOS

Análisis por electroforesis en geles de polacrilamida, inmunodetección y autorradiografía de las Pris obtenidas de diferentes especies

Según los patrones electroforéticos de cada uno de los preparados de las diferentes Prl(s) analizadas, en los preparados de oPrl, pPrl y hPrl observamos 2 bandas de pesos moleculares que oscilaron entre 23 y 25 kDa. La bPrl y la rPrl, se caracterizaron por una banda única con pm aproximado de 24 kDa. Como se observa en la figura 1, los preparados de oPrl, pPrl y hPrl de origen hipofisario se caracterizaron por la presencia de 2 bandas proteínicas con pesos moleculares idénticos. La banda mayoritaria tiene un pm aproximado de 23 kDa que representa aproximadamente el 70 % del contenido de la Prl inmunorreactiva y que corresponde a la forma monomérica de la hormona. La otra banda de 25 kDa, corresponde a la forma glucosilada de la hormona y representó el resto del contenido total de la Prl en las muestras. La rPrl y la bPrl se caracteriza- ron por una banda única con pm de 24 kDa.

FIG. 1. Separación electroforética de los distintos tipos de prolactina: prolactina ovina (oPrl), por-cina (pPrl), humana (hPrl), de rata (rPrl) y bovina (bPrl).

Cromatografía HPLC de los preparados de Prl hipofisaria de distintas especies

De acuerdo con los patrones de elución por HPLC, los diferentes preparados de Prl se resolvieron generalmente en una sola área cuyos tiempos de retención aparecen en la tabla 1. En el caso de la hPrl, encontramos una zona de elución con tiempo de retención de 30,67 min. La pPrl presenta un área máxima de elución con tiempo de retención de 30,92 min.
 
 

TABLA 1. Tiempos de retención obtenidos para el componente principal de Prl separado por cromatografía de gel filtración en HPLC


Tipo de prolactina  Tiempo de retención (min) 
pPrl 30,92
oPrl 31,56
rPrl 30,57
bPrl 34,32
hPrl 30,67


Determinación del punto isoeléctrico (pi) de la Prl hipofisaria de diferentes especies

En la tabla 2 se pueden observar los pi(s) para las diferentes Prl(s) hipofisarias estudiadas. Con excepción de la rPrl, todas las demás mostraron varios componentes definidos de pH. Para la bPrl, observamos 4 bandas con pi que oscilaron entre 5,8 y 6,6 unidades de pH.
 
 

TABLA 2. Valores de puntos isoelétricos determinados para las diferentes isoformas de los preparados de prolactina
Tipo de
Bandas
PI
Prl 
observadas
determinado
bPrl
1
6,6
 
2
6,2
 
3
6,0
 
4
5,8
oPrl
1
6,2
 
2
6,0
 
3
5,0
rPrl
1
6,8
pPrl
1
6,3
 
2
6,0
hPrl
1
5,9
 
2
5,3
 
3
5,6


Determinación de la capacidad de unión a receptores microsomales

En la figura 2 aparecen las diferentes curvas de desplazamiento obtenidas con los distintos preparados de las Prl(s) hipofisarias. En éste análisis empleamos 150 m g de proteína de la fracción microsomal hepática los cuales incubamos en presencia de concentraciones crecientes de las Prl(s) hipofisarias de diferentes especies (3,9-1 000 ng) y de 2 ng de I 125-hPrl. La fracción libre (L) de la unidad (U) la separamos por centrifugación y graficamos los porcentajes de hormona unida al receptor contra las concentraciones de la hormona no radiactiva para construir las curvas de desplazamiento características para las distintas Prl(s) hipofisarias analizadas. En la figura 3 se muestran las gráficas de Scatchard de los distintos tipos de Prl(s) construidas a partir de los datos de las curvas de desplazamientos.

FIG. 2. Curvas de desplazamiento de la unión de los distintos tipos de prolactinas a sus receptores.

FIG.3. Ploteo de Scatchard de las prolactinas de diferentes especies.

En la tabla 3 expresamos los valores de actividad biológica informados para cada uno de los preparados de Prl(s) hipofisarias. Los autores no especifican cuáles fueron los métodos utilizados para determinar la actividad biológica.

Tabla 3. Valores de actividad biológica reportados para los distintos preparados de prolactina hipofisaria
Tipo 
Código
Actividad
de Prl 
(NIH)
biológica(UI/mg)
rPrl
NIDDK-rPrl-RP-(AFP-4459B)
30,0
bPrl
USDA-bPrl-B1(AFP-5300)
13,0
hPrl
NIDDK-hPrIB-1(AFP-8982 C)
40,0
pPrl
USDA-pPrl-B-(AFP-5300)
34,0
oPrl
NIAMDD-oPrl-14
38,9

En la tabla 4 aparecen los valores de Kd y Ka encontrados para las Prl(s) hipofisarias de diferentes especies. La mayor afinidad por el receptor microsomal lo mostró la hPrl, (Kd de 3,16 x107 M), seguido por la bPrl y la oPrl con valores de Kd de 3,15 x 10 7 y 1,94 x 107 M, respectivamente.

Tabla 4. Constantes de disociación (Kd) y de afinidad (Ka) para los diferentes tipos de prolactina hipofisaria
Hormona 
Ka (M-1)
Kd (M)
bPrl
3,15 x 107
3,18 x 10-8
oPrl
1,94 x 107
5,15 x 10-8
hPrl
3,16 x 107
3,16 x 10-8
pPrl
 
2,25 x 10-7
rPrl
 
1,67 x 10-7


DISCUSIÓN

Durante los últimos años se ha considerado al polimorfismo molecular de la Prl como uno de los mecanismos de regulación de la actividad biológica y vida media de la hormona. Esta propiedad permite a la Prl participar en la modulación y regulación in vivo de un número importante de funciones bioquímicas y fisiológicas. Parte del polimorfismo molecular de la Prl se debe a la asociación de monómeros, por lo que es posible encontrar en la circulación, además de la forma monomérica mayoritaria, las variantes diméricas (big) y poliméricas (big-big) de la hormona. Algunos autores han sugerido que las proporciones entre estas formas circulantes de alto peso molecular pueden variar en ciertos estados fisiológicos y patológicos como son el embarazo, la hiperprolactinemia con función ovárica conservada y la hiperprolactinemia de origen tumoral.33-37

El polimorfismo molecular de la Prl también puede asociarse a modificaciones de la molécula por enzimas de naturaleza proteolítica que dan lugar a la generación de péptidos con grados variables de actividad biológica. 38 Durante años se conoce de la existencia de variantes moleculares de la Prl asociadas a modificaciones postransduccionales. Dentro de éstas las más representativas son las formas glucosiladas, fosforiladas, desaminadas y sulfatadas. La especie glucosilada, con excepción del bovino, se encuentra en la mayoría de las especies de mamíferos que se han estudiado.39-43

Nuestros resultados concuerdan con estas observaciones y confirman que la forma glucosilada de la Prl, es la modificación postransduccional más frecuente en las especies estudiadas. En todos los preparados analizados observamos la variante glucosilada de la Prl que, en algunos casos, representó hasta el 50 % del contenido hormonal total.42 La bPrl no contiene una fracción glucosilada y en esta especie predomina la variante sulfatada. Aunque los informes relacionados con la actividad biológica de la Prl glucosilada son contradictorios,44,45 la mayoría de los autores han demostrado que es inferior a la de su contraparte no glucosilada.46,47 Sin embargo, como la glucosilación altera en forma selectiva la actividad biológica de la Prl,48 los resultados pueden ser variables y depender tanto del sistema de bioanálisis que se utilice, como de determinadas condiciones fisiológicas. La relación entre las proporciones de prolactina glucosilada y no glucosilada dentro de la composición de los diferentes preparados que se utilizan en las investigaciones es un factor que debe ser considerado, porque los métodos actuales para obtener Prl altamente purificada no excluyen la posibilidad de que los preparados contengan determinadas proporciones de la hormona estructuralmente modificada por sucesos postransduccionales.

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en filtración en gel de los diferentes preparados analizados y con grados comparables de purificación demostró que la hPrl presenta el mayor grado de variabilidad molecular.

Estos resultados están de acuerdo con los obtenidos por SDS-PAGE. En todos los casos, la mayor concentración de la Prl se resolvió en una sola área con tiempos de retención similares, excepto para el caso de la bPrl, que mostró tiempos de retención mayores. Es posible que los grupos sulfatos presentes en la molécula de bPrl, modifiquen el patrón de elución por gel filtración de la hormona.

El polimorfismo molecular de la Prl se expresa por la existencia de diferentes formas moleculares de la hormona, las cuales pueden estar presentes en la circulación, así como en sitios de su síntesis y en depósitos metabólicos. Estas formas pueden ser agregados moleculares, escinciones, deleciones o pérdidas de determinados fragmentos de la molécula y cambios estructurales de tipo postransduccionales. Según nuestros resultados, en los preparados de la Prl hipofisaria de diferentes especies existen isoformas de la hormona que se diferencian por su punto isoeléctrico. De acuerdo con los resultados obtenidos por SDS-PAGE, la bPrl es un preparado de composición molecular homogénea; sin embargo, se encontró que existen 4 isoformas con valores de pi en un rango comprendido entre 5,8 y 6,6 lo que pudiera tener algún significado fisiológico.

Durante los últimos años se han descrito diferentes métodos para determinar la actividad biológica de las hormonas lactogénicas. 45 Hasta el presente todos los procedimientos utilizados poseen ventajas y desventajas. El RRA es útil para determinar la capacidad de la hormona de ser reconocida por los receptores de membrana, pero no así para predecir cambios relacionados con la transducción de la señal. Nuestros resultados coinciden con los de otros autores que han demostrado que en el análisis por RRA, la menor capacidad de unión para las hormonas se obtiene en sistemas homólogos, sin que exista hasta el momento una explicación concluyente.49

Cuando se analizan conjuntamente los resultados de la unión de los distintos preparados de Prl(s) hipofisaria a los receptores microsomales y sus Kd con los valores de actividad biológica informados por los suministradores, se observa una marcada discordancia. Esto demuestra claramente, que los preparados hormonales de origen hipofisario, pueden mostrar una actividad biológica que va a ser dependiente del tipo de bioensayo utilizado y del origen del preparado analizado.

En conclusión, es sumamente importante elegir el tipo de Prl a ser utilizada para el desarrollo de experimentos bajo condiciones in vivo o in vitro. Las razones se encuentran relacionadas con el origen del preparado hormonal, incluyendo su estructura y composición, así como la heterogeneidad molecular y eléctrica, además de la propia actividad biológica del preparado. Es probable que durante el proceso de purificación de la Prl ocurran cambios en la estructura de las moléculas como son la formación de agregados, escinciones proteolíticas y la formación de combinaciones entre monómeros glucosilados y no glucosilados. Estas variaciones estructurales podrían alterar en forma definitiva las características bioquímicas y biológicas de los preparados hormonales que se utilizan con fines experimentales.

AGRADECIMIENTOS

Los autores desean expresar su agradecimiento a The National Hormone and Pituitary Program, NIDDK,NICHHD y al USDA por los reactivos e informa-ción suministrados.

SUMMARY

Different techniques were used to determine the biochemical characteristics of the Prolactin (Prl) preparations of hypophyseal origin with preparations that are used in research centers for the development of in vitro and in vivo systems, bioanalyses, radioimmunoanalyses and immunoenzimatic analyses. The preparations were analyzed by electrophoresis under reducing conditions (SDS-PAGE), electrotrasnference and immunodetection, isoelectric focussing, high pressure liquid chromatography (HPLC) and binding capacity to microsomal receptors (RRA). It was observed that in the porcine Prl (pPrl), ovine Prl (oPrl) and human Prl (hPrl) there are significant proportions of the glycosilated form (30-40%) that are not found in the bovine Prl (bPrl) and in the rat Prl (rPrl). It was proved that it is possible to detect impurities or mixtures of the different molecular forms of Prl that appear in these hypophyseal preparations by using HPLC. The analysis by isoelectric focussing of the hypophyseal prolactins of different species revealed that in the bPrl there are 4 isoforms of electric charge, that the oPrl and the hPrl are composed of 3 isoforms, whereas the rPrl and the pPrl have 1 and 2 isoforms, respectively. The physiological meaning of the isoforms of electric charge in the hypophyseal Prl of different species is still unknown. According to the results obtained from the displacement curves and from the Scatchard graphs, it was found that there are differences among the dissociation constants (Kd) and the binding capacity of prolactins to microsomal receptors. Finally, it is necessary to know with more precision the biochemical, immunological and biological properties of the preparations of prolactins that are used in different studies, both in vivo and in vitro, since that's where the biological functions of the hormone are. The structural heterogeneity of the Prl was confirmed and widened in different species of mammals giving rise to the existence of different molecular variants of the hormone and to the diversity of functions it performs. The need to develop new methods for studying the biological meaning of the structural heterogeneity of Prl and to obtain different molecular variants of Prl with a degree of purity that allow to establish new quantitative methods useful to be applied in clinical and biochemical studies was proved. The adequate understanding of the structural modifications of prolactins and of their biological consequences will make possible to establish the synthesis and secretion mechanisms of this hormone, including its multifunctional properties.

Subject headings: PROLACTIN/chemical; IN VITRO; ELECTROPHORESIS/methods; ISOELECTRIC FOCUSING/methods; CHROMATOGRAPHY, HIGH PRESSURE LIQUID/methods.

 

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Recibido: 9 de mayo de 2000. Aprobado: 9 de junio de 2000.
Lic. Víctor Cabrera Oliva. Instituto Nacional de Endocrinología, Zapata y D, El Vedado, Ciudad de La Habana, Cuba. CP 10400.
 
 

1 Licenciado en Bioquímica.
 

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