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Rev Cubana Endocrinol 2000;11(3):174-80

Instituto Nacional de Endocrinología
Hospital Provincial de Pinar del Río "Abel Santamaría"
Instituto Nacional de Cardiología y Cirugía Cardiovascular

Montaje y estandarización para determinar colesterol inmune en suero humano

RESUMEN

Descriptores DeCS: LIPOPROTEÍNAS LDL; AUTOANTICUERPOS; ESTANDARES DE REFERENCIA; COLESTEROL.

El desarrollo actual de las investigaciones en el campo de la arterosclerosis ha permitido acumular muchas evidencias acerca de la importante función que desempeña la modificación oxidativa de las lipoproteínas aterogénicas en la presencia y progresión de la misma. La concentración elevada de la lipoproteína de baja densidad (LDL) constituye uno de los mayores factores de riesgo para la arterosclerosis. Estudios clínicos, epidemiológicos y genéticos, han demostrado convincentemente que la LDL promueve la enfermedad, aunque el mecanismo preciso por el cual esta provoca el desarrollo de la aparición temprana de las estrías de grasa no ha sido aún dilucidado.

La LDL oxidada entra a la célula por un mecanismo no regulado, mediado por un receptor de membrana que se denomina receptor scavenger y que se encuentra fundamentalmente en los macrófagos y las células musculares lisas, aunque se han detectado también en las células endoteliales.¹ La LDL oxidada tiene un elevado potencial aterógeno, ya que al tener bloqueados residuos de lisina y arginina presenta una densidad de carga positiva menor que la LDL nativa, por lo que ya no es reconocida por el receptor Apo B100/E, mientras que sí lo es por el receptor scavenger de los macrófagos y las células musculares lisas de la pared vascular. Al no estar regulado, este receptor permite a las células cargarse indefinidamente de colesterol hasta transformarse en células espumosas, que se depositan en el vaso y desempeñan una función esencial en la génesis y el desarrollo de la lesión ateromatosa, además de adquirir una serie de propiedades citotóxicas y quimiotácticas para el sistema monocito-macrófago que contribuyen a su carácter aterógeno.¹

Aparentemente, la LDL oxidada es más inmunogénica que la LDL nativa, lo cual sugiere que el nivel de autoanticuerpos contra ellas refleja la extensión en vivo de la oxidación de la LDL nativa. La medición directa de la LDL oxidada en suero o plasma no es factible por la protección que sobre ella tienen los agentes antioxidantes presentes en la circulación general, es por eso que el descubrimiento de los autoanticuerpos contra las LDL oxidada en suero humano y la formación del complejo inmune estimulan la acumulación de éteres de colesterol en macrófagos lo cual da lugar a la formación de las células espumosas.^2-4

El objetivo de nuestro trabajo es el montaje y estandarización de la determinación del inmunocomplejo circulante (autoanticuerpo-LDL oxidada) en suero humano, enfocado y desarrollado como parte del esfuerzo dirigido a lograr métodos de elevada calidad y factibles de ser empleados por los laboratorios clínicos de nuestra red de salud en el estudio de la aterosclerosis.

MÉTODOS

Reactivos

• Polietilénglicol 6 000 (PEG). Merck.
• Kit enzimático colorimétrico para determinar colesterol total de la Boehringer Mannhein.⁵
• Calibrador comercial Preciset cholesterol de la Boehringer Mannhein.

Equipos

• Baño circulatorio termostatado. HAAKE D1.
• Centrífuga Eppendorf.
• Espectrofotómetro Ultrospec 2 000 Pharmacia Biotech.

Método analítico

El precipitado fue resuspendido directamente en 1 mL del reactivo de colesterol e incubado 20 min a temperatura ambiente, hasta el desarrollo del color, las lecturas se realizaron a 500 nm en el espectrofotómetro, en cubetas plásticas de 1,25 mL de volumen, de 1 cm de paso de luz de la Sarsted.

Evaluación analítica del método

La linealidad del método se obtuvo después de promediar 12 curvas de calibración, de 6 puntos en un rango de 5 a 40 µg/mL, con un incremento de 5µg/mL, y por triplicado cada punto de la curva. Para el estudio de la repetibilidad y de la reproducibilidad se analizaron 3 muestras de sueros frescos, que abarcaban la zona baja, la media y la alta de la curva de calibración, para la repetibilidad fueron procesadas 12 veces en una misma corrida y para la reproducibilidad se procesaron 3 réplicas de cada muestra por corrida a lo largo de 6 corridas analíticas. El límite de detección fue calculado del estudio de reproducibilidad y se consideró valor promedio correspondiente a la media de densidad óptica más 2 desviaciones estándar (2DE) del valor de absorbancia obtenido para el calibrante cero en 6 corridas.

La recuperación del método se realizó con 3 muestras de concentración conocidas de colesterol inmune, las que fueron suplementadas con concentraciones exógenas conocidas del analito.

Para estimar el valor diagnóstico del "colesterol inmune" en la enfermedad arterial coronaria se determinó la sensibilidad, la especificidad, el valor predictivo positivo y el negativo a partir del procesamiento de 50 muestras de suero tomadas de banco de sangre al azar "casos normales", y 65 muestras de pacientes escogidos consecutivamente al azar entre los asistentes a la Consulta de Cardiopatía Isquémica en el Instituto Nacional de Cardiología y Cirugía Cardiovascular "casos patológicos". Se utilizó como valor de corte del "colesterol inmune" de normales y patológicos (< 15 µg/mL), valor este reportado en la literatura como criterio de riesgo de aterosclerosis coronaria.⁸

Las fórmulas utilizadas fueron:

# de individuos enfermos con

resultado patológico

Sensibilidad = x 100

# total de individuos enfermos

# de individuos sanos

con resultado normal

Especificidad = x 100

# total de individuos sanos

# de individuos enfermos

con resultado patológico

Valor predictivo = x 100

positivo (VPP) # total de individuos con

resultados patológicos

# de individuo sanos

con resultado normal

Valor predictivo = x 100

# total de individuos

con resultados normales

Análisis estadístico

RESULTADOS

La figura 1 muestra la curva dosis-respuesta de la determinación del colesterol en el precipitado inmune con PEC, la curva obtenida es el resultado de promediar 12 corridas, se obtuvo una adecuada respuesta lineal, que se corrobora con los resultados del análisis de la regresión, donde se pudo computar la recta de mejor ajuste para los puntos. Se observó un desplazamiento proporcional de la densidad óptica a las diferentes concentraciones de colesterol del precipitado del inmunocomplejo autoanticuerpo-LDLox. El rango de concentración de la curva patrón fue de 5 a 40 m g/mL.

Fig. 1. Gráfico del comportamiento de la curva patrón (n=12).

El límite de detección del método fue de 0,5 m g/mL, concentración que no hemos encontrado en las nuestras de suero utilizadas en el estudio de montaje y estandarización del método.

En la realización del estudio de precisión, los resultados fueron satisfactorios, como se muestra en la tabla 1. La repetibilidad del método evaluada a través de 3 muestras de suero rindió un coeficiente de variación promedio de 3,7 %, el cual consideramos adecuado para este tipo de determinación, de forma similar los resultados obtenidos en el estudio de reproducibilidad aportó un coeficiente de variación promedio de 4,5 %, superior a los del estudio de repetibilidad como era de esperar. Se calculó el coeficiente de variación total para cada muestra los cuales fueron 7,14; 5,13 y 4,38 %.

Los resultados del estudio de recuperación se muestran en la tabla 2, el porcentaje de recuperación promedio de las 3 muestras estudiadas fue del 96,3 %. Cuando ploteamos los datos esperados (teóricos) en el eje de las abscisas vs. los datos observados (reales) de las 3 muestras suplementadas (fig. 2) en 3 zonas diferentes de la curva patrón obtuvimos una recta de regresión de pendiente 0,94 e intercepto 0,37, y r =1,000.

FIG. 2. Relación entre los valores de concentración observados y esperados del estudio de recuperación.

Para un valor de corte de 15 µg/mL.^7,8

Criterio: riesgo si el colesterol inmune es > 15 µg/mL

• 80 % sensibilidad, lo que significa que hay un 20 % de individuos enfermos que no son detectados, o sea de cada 100 muestras patológicas se reportan como normales 20 por el colesterol inmune.
• 80 % especificidad, lo cual significa que hay un 20 % de individuos sanos que no se determinan como tal, o sea, de cada 100 muestras normales, se reportan como patológicos por el colesterol inmune 20 que verdaderamente no lo son.
• 84 % como valor predictivo positivo (VPP), o sea, de cada 100 casos clasificados como patológicos por el colesterol inmune, 16 de ellos realmente no lo son.
• 76 % como valor predictivo negativo (VPN), esto implica que de cada 100 casos reportados como normales por el colesterol inmune, 24 de ellos son realmente patológicos.

DISCUSIÓN

La peroxidación de los lípidos de las LDL y la subsecuente generación de aldehídos reactivos, producen cambios en la apo B 100, que modifican marcadamente las propiedades de las LDL. Este proceso estimula la formación de autoanticuerpo (IgG, IgM), los que reconocen a estas apo B100 modificadas.⁴

Como se comentó en la introducción, la medición directa de la LDL oxidada en suero o plasma no es factible por la protección que sobre ella tienen los agentes antioxidantes presentes en la circulación general, es por ello que la determinación de los autoanticuerpos contra las LDL oxidadas en suero humano ha despertado gran interés en los últimos años.

Los resultados que presentamos avalan la calidad analítica del método desarrollado para cuantificar el colesterol presente en el inmunocomplejo autoanticuerpo-LDLox.

En la curva patrón se observó que hay un desplazamiento proporcional de la densidad óptica a las diferentes concentraciones y el límite de detección concuerda perfectamente con los encontrados por Alexander N Orekhov y otros en 1995.⁸

Los coeficientes de variación de la repetibilidad y la reproducibilidad son menores del 10 %, para la 3 muestras analizadas en el estudio, por tanto consideramos que nuestros resultados son adecuados según las características del método desarrollado. Estos resultados nos permiten afirmar que una primera evaluación de las muestras con concentraciones desconocidas garantizó una buena precisión para concentraciones de colesterol entre 5 y 40 µg/mL. Este rango incluye el valor de concentración de significación clínica que es 15 µg/mL, pues se ha visto que valores de "colesterol inmune" de esta magnitud o superiores están asociados generalmente con un alto riesgo de padecer trastornos ateroscleróticos.

La recuperación del método estuvo dentro de los valores permisibles para tipo de sistema, considerado satisfactorio en este tipo de método donde el valor aceptado es de 90-100 %. Estos resultados demuestran que la exactitud del método en términos de recuperación es satisfactoria, lo cual garantizó que más del 95 % del colesterol presente en el inmunocomplejo precipitó con el PEC y pudo ser cuantificado.

Para estimar el valor diagnóstico del "colesterol inmune" en la aterosclerosis de cualquier grado de estenosis se determinó la sensibilidad, la especificidad, y los valores predictivos positivos y negativos del mismo. Para realizar el análisis de estos resultados es necesario tener en cuenta que en el grupo de sujetos "supuestamente normales", sacados de banco de sangre, como indica la palabra, no se sabe con certeza cuántos son realmente sanos, pues para ello sería necesario realizarles la coronariografía, prueba invasiva y costosa, que no procede en este tipo de estudio en sujetos sin signos ni síntomas de enfermedad coronaria. La sensibilidad y la especificidad diagnósticas del colesterol inmune obtenidas en nuestro trabajo es similar a la obtenida por Alexander N Orekhov y otros.⁸ Ellos en su estudio calcularon el valor de otros parámetros lipídicos para el diagnóstico de laboratorio y concluyeron que el colesterol inmune era el mejor marcador diagnóstico entre los parámetros lipídicos analizados.

Los resultados obtenidos en este trabajo son satisfactorios y, a nuestro juicio, el sistema analítico posee los atributos de calidad adecuados para su utilización, en las investigaciones de la aterosclerosis coronaria, cerebral y periférica, donde el "colesterol inmune" puede ser evaluado como marcador de aterosclerosis en poblaciones con un estadio temprano de la misma.

SUMMARY

Subject headings: LDL LIPOPROTEINS; AUTOANTIBODIES; REFERENCE STANDARDS; CHOLESTEROL.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Brow MS, Goldtein J. Lipoprotein metabolism in the macropahge. Ann Rev Biochem 1983;52:223-61.
2. Jialal J, Scacini C. Laboratory assessment of lipid, lipoproteins, and apolipoproteins. En: Rifai N, Warnick GR, eds. Recent advances in lipid and lipoprotein analysis. Washington, DC: AACC Press, 1993;17:307-21.
3. Maggi E, Chiesa R, Milissano G, Castellano R, Astoru D, et al. LDL oxidation in patient with severe carotid atherosclerosis. Arterioscler Thromb 1994;14:1892-9.
4. Bellomo G, Maggi E, Poli M, Agosta FG, Bollati P, Finardi G. Autoantibodies against oxidatevely modified low density lipoproteins in NIDDM, Diabetes 1995;44(1):60-6.
5. Allain CC, Poon LS, Chan CSG. Enzimatic determination of total serum cholesterol. Clin Chem 1974;20:470-5.
6. Tertov W, Orekhov AN, Kacharava AG, Sobenin I, Perova NV, Smirnov VN. Low density lipoprotein-containing circulating immune complexes and coronary atherosclerosis. Exp Mol Pathol 1990;52:300-8.
7. Tertov W, Orekhov AN, Sayadyan KHS, Serebrennikov SG, Kacharava AG, Lyakishev AA, et al. Correlation between cholesterol content in circulating immune complexes and atherogenic properties of CHD patient´s serum manifested in cell culture. Atherosclerosis 1990;81:183-9.
8. Orekhov AN, Kacharava AG, Tertov W, Perova NV. Diagnostic value of immune cholesterol as a marker for atherosclerosis. J Cadiovasc Risk 1995;2:459-66.
9. Thielman K. Principios de metodologías en bioquímica clínica. La Habana: Instituto Cubano del Libro, 1973:303-8
10. Holvoet P, Callen D. Oxidized lipoproteins in atherosclerosis and thrombosis. FASEB 1994;8(15):1279-84.

¹ Licenciada en Bioquímica. Investigadora. Instituto Nacional de Endocrinología.
² Doctor en Ciencias. Especialista de II Grado en bioquímica Clínica.
³ Licenciada en Biología.