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Rev Cubana Endocrinol 1997;8(3):192-200
Instituto Nacional de Endocrinología

Formas glicosiladas y no glicosiladas de la prolactina porcina sobre la esteroidogénesis ovárica in vitro

Lic. Julio César Rodríguez García, Lic. Víctor Cabrera Oliva, Lic. Alina Chapé Puertas2 y Dra. Ada Julia Machado Curbelo

RESUMEN

Se investigaron los efectos de la prolactina porcina glicosilada (gpPrl) y la no glicosilada (ngpPrl) aislada y junto a la gonadotropina coriónica humana (HCG) en la acumulación de progesterona (P) y estradiol (E2). Se obtuvieron células de granulosa a partir de folículos preovulatorios de ratas inmaduras tratadas con gonadotropina obtenida de suero de yegua preñada (PMSG). Cuando se adicionaron concentraciones de 1, 10 y 100 ng/mL de gpPrl o ngPrl a cultivos celulares no estimulados con HCG aumentó la acumulación de P a las 72 h de incubación, aunque la gpPrl mostró un efecto estimulatorio más marcado. La acumulación de E2 se incrementó con la administración de concentraciones de 1 y 10 ng/mL de gpPrl junto con 0,1 UI/mL de HCG, la concentración de 100 ng/mL no mostró un efecto estimulatorio significativo. Los resultados obtenidos sugieren que la producción de P y E2 por célula de granulosa de rata en cultivo depende de la forma de Prl usada en los experimentos así como de la presencia de HCG como agente estimulatorio de la esteroidogénesis en el medio de cultivo.

Descriptores DeCS: PROLACTINA/análogos & derivados; PROLACTINA/aislamiento & purificación; GONADOTROPINAS CORIONICAS; CELULAS GRANULOSAS; CULTIVOS CELULARES; PROGESTERONA; ESTRADIOL; RATAS SPRAGUE-DAWLEY.

La prolactina (Prl) es la más versátil de las hormonas pituitarias en número y diversidad de procesos fisiológicos que regula.1-3 En años recientes, el análisis por Western blot ha permitido identificar una variante glicosilada de la Prl (gPrl) con un peso molecular de 25 KDa en suero de mujeres y hombres normales,4,5 en fluido amniótico, como producto de la fase luteal del endometrio y en tejido desidual a término.6 La gPrl ha sido encontrada también en extractos pituitarios de especies no humanas como: paloma, pavo, cerdo y camello.7-10 La razón para la glicosilación de la Prl no está esclarecida. Algunos investigadores han sugerido que la glicosilación puede modular la actividad de la Prl por intensificación de su actividad en ciertos tejidos, mientras debilitan estos efectos sobre otros.11 Reportes recientes relacionados con la determinación de la actividad biológica de la gPrl concuerdan con que la glicosilación disminuye la capacidad de la Prl para unirse a un antisuero policlonal, receptores microsomales y receptores de células Nb2.12,13

Pankov y Butnev,14 mediante un bioensayo en células de buche de paloma, encontraron que la Prl porcina glicosilada (gpPrl) tiene una actividad claramente superior a la variante no glicosilada (ngpPrl). Sin embargo, estudios que muestran la influencia de la gPrl sobre la esteroidogenésis ovárica, con el uso de células de granulosa en cultivo, no han sido descritos aún. El objetivo de este estudio es determinar el efecto de la gpPrl y la ngpPrl sobre la síntesis de progesterona (P) y estradiol (E2) en células de granulosa en cultivo.

MÉTODOS

Separación de las formas glicosiladas y las no glicosiladas de la pPrl

Separamos las formas glicosiladas de la pPrl usando una columna de Sepharosa-concanavalina A (ConA). Equilibramos la columna (1x4cm) con Tris-HCl 20 mM, NaCl 500 mM, pH 8,5, seguido de a-D-metilmanósido (DMM) en Tris-HCl para remover los restos de ConA no acoplados a la matriz.

Antes de la aplicación de la pPrl, lavamos la columna extensivamente con Tris-HCl. Solubilizamos la pPrl (5 mg, USDA-pPrl-B-1) en 1 mL de Tris-HCl; la aplicamos y la recirculamos a 5 mL/h, durante 1 h, para garantizar la máxima unión de la gpPrl. Eluímos la ngpPrl con Tris-HCl a un flujo de 10 mL/h, colectamos fracciones de 1 mL y monitoreamos el contenido de proteína midiendo DO a 280 nm. Eluímos la Prl retenida (gpPrl) con DMM 200 mM en Tris-HCl. Las fracciones eluídas de cada forma fueron puleadas por separado, dializadas extensamente para eliminar el Tris-HCl y, finalmente concentradas a 1 mL en AMICON mediante una membrana de 10 KDa; realizamos todo el procedimiento a 4 °C.

Determinamos el contenido de proteínas del pool concentrado mediante Lowry de proteínas15 y la pureza de las fracciones separadas, por electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE), en un gel al 12,5 % con un sistema de tampón discontinuo de Laemmli,16 las fracciones glicosiladas y las no glicosiladas fueron alicuotadas y guardadas a -70 °C hasta su uso en los cultivos celulares.

Animales

Empleamos ratas hembras inmaduras Sprague-Dawley (21-23 días de nacidas) de la unidad local de animales del Instituto Nacional de Endocrinología. Mantuvimos los animales bajo condiciones ambientales controladas, 25 °C con períodos de iluminación (14 h/d) y libre acceso a comida y agua. El Comité Institucional de Protección Animal verificó su cuidado y uso.

Los tratados con dosis superovulatorias de PMSG (12 UI/100 mL de PBS) para obtener folículos preovulatorios, los sacrificamos por dislocación cervical 48 h después de ser estimulados.

Colección y cultivo de células de granulosa

Empleamos medio de cultivo libre de suero que contiene una mezcla 1:1 (v/v) de Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Gibco Limited, Scotland), y Ham's F-12 (Serva, Heidelberg, Switzerland), pasado por un tampón con HEPES 20mM, pH 7,4 y suplementado con 100 m/mL de penicilina, 100 mg/mL de estreptomicina y 2,5 mg/mL de fungisona (Flow Laboratories, Irvine, Scotland).

Colectamos y cultivamos las células de granulosa como se describe en la literatura.17 Previo al cultivo, los ovarios fueron removidos y desprovistos de tejido adyacente, para eliminar las uniones entre las células de granulosa, incubamos los ovarios 45 min a 37 °C en medio suplementado con sacarosa 500 mM y EGTA 100 mM, seguido de 45 min de incubación en medio base a temperatura ambiente. Colectamos las células puncionando los folículos con aguja hipodérmica. Lavamos la suspensión celular 2 veces con medio base y centrifugamos a baja velocidad (330 x g) durante 15 min a 4 °C. Realizamos el conteo celular con dilución 1:2 con Tripan Blue en un hemocitómetro. La viabilidad celular obtenida fue del 70 %.

Establecimos los cultivos y limitamos la concentración celular a 2 x 105 células viables por pozo en 1 mL de medio, los sembramos en placas multipozos de 24 pozos con 6 réplicas para cada concentración a ensayar.

Suplementamos el medio de cultivo para el ensayo con 15 mL de una mezcla de insulina, transferrina e hidrocortisona para lograr una concentración final de 2 mg/mL de insulina, 40 ng/mL de hidrocortisona y 5 mg/mL de transferrina. A los pozos, previamente, les añadimos 200 mL de suero fetal durante 3 h para facilitar la adhesión celular.

Después de un período inicial de cultivo de 24 h a 37 °C en atmósfera húmeda al 95 % de O2: 5 % de CO2, las células se adhieren al fondo del pozo y se les adicionan las diferentes concentraciones de gpPrl, ngpPrl, y HCG a ensayar (HCG, CR-121; 13,5 UI/mL obtenida por cortesía del Dr. Canfield, England). Después de 72 h de incubación, colectamos y congelamos el medio hasta su ensayo hormonal. Cada grupo experimental fue representado por 6 pozos de cultivo. Los datos que mostramos son los valores obtenidos de 3 experimentos separados.

Ensayamos 3 concentraciones diferentes de la hormona en dosis correspondiente a estadios fisiológicos de hipoprolactinemia (1 ng/mL), normoprolactinemia (10 ng/mL) e hiperprolactinemia (100 ng/mL), para ambas formas moleculares. Empleamos la HCG a una concentración fija de 0,1 UI/mL, previamente determinada, la cual posee efecto estimulatorio significativo sobre la esteroidogénesis ovárica en cultivo.

RIA de hormonas

Determinamos la concentración de P y E2 por RIA en cada muestra; la P, mediante una variante de RIA yodado (I125), suplementa por The World Health Organization Matched Reagent Program. Este antisuero tiene una reacción cruzada de 1,6 % con 17-OH-P, 0,04 % con 20-dihidro-P, 0,02 % con testosterona (T) y 0,002 % con cortisol. La sensibilidad del ensayo fue de 6-12 %, respectivamente. Medimos el E2 empleando un kit de reactivos RIA-H3 aportado por la misma organización antes mencionada, cuyo antisuero posee una reacción cruzada de 0,8 % con estriol y menos del 0,02 % con estrona, P y T. La sensibilidad del ensayo fue de 28 pmol/L. El coeficiente de variación intra e interensayo no excedió del 5 y el 9 %, respectivamente.

Análisis estadístico

Empleamos para el análisis estadístico, un test de ANOVA seguido del test de Duncan's de múltiples rangos. Los valores de 0,05 ó menores fueron considerados significativos.

RESULTADOS

Como se muestra en la figura 1, la preparación de pPrl usada estaba compuesta por las 2 formas de la hormona. El primer pico eluído con Tris-HCl y detectado por su absorbancia a 280 nm corresponde a la ngpPrl. El segundo pico obtenido por elución competitiva con 200 mM de DMM corresponde a la gpPrl. La relación entre las formas glicosiladas y las no glicosiladas fue aproximadamente de 2:1 (ngpPrl:gpPrl). La proteína recobrada de la columna de afinidad fue cercana al 9,4 %. La evaluación por SDS-PAGE de ambas formas de pPrl se muestra en la figura 2 y confirma el patrón cromatográfico. La banda correspondiente a la ngpPrl tenía un PM aparente de 24 KDa, mientras el PM calculado para la banda asignada a la gpPrl fue de 27 KDa.
Figura 1
FIGURA 1. Separación de las formas glicosiladas y las no glicosiladas de la pPrl, por cromatografía de afinidad Sepharosa-ConA.
Figura 2
FIGURA 2. Patrón electroforético en SDS-PAGE de las formas de pPrl separadas por cromatografía de afinidad.

Las líneas 1, 5 y 6 representan los marcadores de PM (Lizosima, 14.3 KDa; Inhibidor de Tripsina, 20 KDa; quimitripsinógeno, 27 KDa; ovoalbúmina, 43 KDa; albúmina sérica bovina, 68 KDa). La línea 2, la pPrl no separada; la línea 3, la ngpPrl y, la línea 4, la gpPrl.

Efecto de las formas glicosiladas y las no glicosiladas de pPrl sobre la secreción basal de P

Como se observa en la figura 3, concentraciones de 1, 10 y 100 ng/mL de una y otra forma de la hormona (gpPrl o ngpPrl) incrementaron la secreción de P por células de granulosa en cultivo no estimuladas, en un período de incubación de 72 h. El efecto estimulatorio de la gpPrl en el incremento de los niveles basales de P fue superior al de la ngpPrl, el efecto más significativo fue el observado cuando se emplearon concentraciones de 10 ng/mL de la variante glicosilada, hubo una diferencia significativa respecto al control no tratado y al efecto estimulatorio provocado por igual dosis de ngpPrl. Al tratar los cultivos con dosis de 100 ng/mL disminuyó el efecto estimulatorio de la gpPrl con respecto a la dosis de 10 ng/mL aunque se mantuvo un efecto estimulatorio significativo respecto al control y superior al provocado por igual dosis de ngpPrl, en cuyo caso correspondió con el máximo observado para la variante no glicosilada.

Figura 3
FIGURA 3. Efectos de la gpPrl sobre la secreción basal de P por células de granulosa en cultivo.

Efectos de las formas glicosiladas y las no glicosiladas de pPrl sobre la secreción de P inducida por HCG

Incubamos los cultivos durante 72 h con 1, 10 y 100 ng/mL de ambas formas de la hormona, conjuntamente con 0,1 UImL de HCG. La dosis de HCG administrada ha demostrado ser óptima para un efecto estimulatorio máximo, lo que se determinó en experimentos previos. No encontramos efecto significativo de ninguna de las formas pPrl sobre la producción de P estimulada por HCG, al final del período de incubación.

Efectos de las formas glicosiladas y las no glicosiladas de pPrl sobre la secreción basal de E2

Ambas formas a concentraciones de 1 y 10 ng/mL no mostraron efectos sobre la secreción de E2 al final del período de incubación. Sin embargo, cuando los cultivos fueron tratados con 100 ng/mL de gpPrl, los niveles de E2 aumentaron significativamente comparados con los cultivos tratados con igual dosis de ngpPrl, la cual muestra un efecto inhibitorio respecto al control no tratado.

Efectos de las formas glicosiladas y las no glicosiladas de pPrl sobre la secreciónde E2 inducida por HCG

Según se observa en la figura 4, en los cultivos estimulados con 0,1 UI/mL de HCG, la ngpPrl mostró un efecto inhibitorio a todas las dosis ensayadas. Las dosis de 1 y 10 ng/mL de gpPrl ejercen un efecto estimulatorio significativo sobre la secreción de E2, potencian el efecto estimulatorio de la HCG, mientras las dosis de 100 ng/mL no mostró efecto sobre los niveles de E2 secretados.

FIGURA 4. Efectos de las gpPrl y ngpPrl sobre la secreción de E2 por células de granulosa en cultivos estimulados con hCG.

DISCUSIÓN

Aunque los efectos de la Prl en la esteroidogénesis ovárica han sido ampliamente documentados, no se reporta la existencia de acciones individuales de la forma glicosilada de la Prl en la producción de P y E2 por las células de granulosa de rata.

Para nuestro conocimiento, este resultado brinda la primera evidencia de acciones directas de la gPrl en la síntesis de P y E2 por células de granulosa de rata en condiciones basales y en condiciones estimulatorias con HCG.

En nuestros experimentos utilizamos concentraciones de 1, 10 y 100 ng/mL de gpPrl o ngpPrl para mimetizar los estados de hiperprolactinemia que tienen lugar en las mujeres. RIAs no homólogos disponibles en el momento del estudio fueron llevados a cabo. Las concentraciones de gpPrl y ngpPrl fueron expresadas en términos de proteínas. En los cultivos de células de granulosa no estimulados con HCG, tanto la gpPrl como la ngpPrl estimularon la síntesis de P de manera dosis dependiente aunque con diferentes sensibilidades.

La producción de P fue máxima cuando los cultivos fueron estimulados con 10 ng/mL (mimetizando los niveles fisiológicos de la hormona en mujeres). Esto se reduce al 50 % cuando se emplean dosis similares de ngpPrl.

Ante concentraciones elevadas de gpPrl y ngpPrl de 100 ng/mL, mimetizando los niveles hormonales de la hiperprolactinemia, se produce una reducción en la acumulación de P en el caso de la gpPrl aunque continúa siendo superior al control y al efecto provocado por la ngpPrl.

En forma contrastante con estos estudios, ninguna de las variantes de la hormonas es capaz de estimular la producción de P en presencia de HCG pues esta hormona en el medio de cultivo cambia la respuesta de las células ante las diferentes concentraciones de gpPrl y ngpPrl empleadas en los cultivos no estimulados.

Con nuestros experimentos mostramos que las gpPrl y ngPrl pueden tener efectos diferenciales sobre la síntesis de E2 por células de granulosa que dependen de la presencia de un agente estimulatorio en el medio. Mientras la gpPrl causa un incremento en la síntesis de E2 a las concentraciones ensayadas en presencia de HCG, la ngpPrl no afecta su producción a las dosis ensayadas excepto a la dosis de 1 ng/mL en presencia de HCG donde ejerce un efecto inhibitorio.

Nuestros resultados sustentan lo encontrado por Pankov y Butnev14 los cuáles reportan una especie de gpPrl con un incremento en la respuesta de las células de buche de paloma y refutan la noción de la actividad biológica reducida de la gPrl.

Aunque autores no mencionados atribuyen el incremento de la actividad biológica de la gpPrl a la naturaleza química de los grupos carbohidráticos presentes en la molécula, nuestros resultados no nos permiten especular sobre esta materia.

Experimentos anteriores sobre el efecto de la hormona en la esteroidogénesis ovárica en condiciones basales y estimulatorias se han realizado usando preparaciones de Prl total, aunque usualmente consisten en una mezcla de gPrl y ngPrl.

Bajo estas condiciones experimentales se detectó que el efecto de la Prl en la esteroidogénesis ovárica depende de la forma de Prl presente en mayor concentración en el medio (ngPrl). Sin embargo, las actividades biológicas y la relación entre ngpPrl y gpPrl puede variar durante los diferentes estadios fisiológicos y patológicos sin alterar la cantidad de la hormona detectada por RIA.18

En resumen, es evidente que las gpPrl y ngpPrl afectan la producción de P y E2 por células de granulosa de rata en cultivo en dependencia de sus concentraciones, así como de la presencia de HCG como agente estimulatorio de la esteroidogénesis.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos la colaboración del Dr. Raiti del Programa Nacional Pituitario, Baltimore, MD, USA por su generoso aporte de la hormona purificada usada en el estudio. Este trabajo fue apoyado, en parte, por la Unión del Programa de Reproducción Humana de la Organización Mundial de la Salud (WHO/HRP).

SUMMARY

The effects of isolated glycosilated (gpPrl) and non-glycosilated (ngpPrl) porcine prolactine, and of human chorionic gonadotropin (hCG) on the accumulation of progesterone (P) and estradiol (E2) were studied in this paper. Granulosa cells were obtained from preovulatory follicles of inmature rats treated with gonadotropin extracted from serum of a pregnant mare (PMSG). When concentrations of 1, 10 and 100 ng/mL of gpPrl or ngPrl were added to the cell cultures non stimulated with hCG, it was observed an increase in the accumulation of P 72 hours after incubation, thoug gpPrl showed a greater stimulating effect. The accumulation of E2 rose as a result of the administration of concentrations of 1 and 10 ng/mL of gpPrl together with 0.1 UI/mL of hCG. No significant stimulating effect was found in the concentration of 100 ng/mL. The results obtained suggest that the production of P and E2 by granulosa cell from rats under culture depend on the form of Prl used in the experiments as well as on the presence of hCG as a stimulating agent of steroidogenesis in the culture medium.

Subject headings: PROLACTIN/analogs & derivatives; PROLACTIN/isolation & purification; GONADOTROPINS, CHORIONIC, GRANULOSA CELLS; CELLS; CULTURED; PROGESTERONE; ESTRADIOL; RATS, SPRAGUEDAWLEY.

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Recibido: 15 de mayo de 1996. Aprobado: 10 de octubre de 1996.

Lic.Julio César Rodríguez García. Instituto Nacional de Endocrinología, Zapata y C, Vedado, Ciudad de La Habana, Cuba. CP 10 400.

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