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Rev Cubana Endocrinol 8(3):230-5

Metodología Diagnóstico

Instituto Nacional de Endocrinología

Producción de los reactivos primarios de un sistema inmunoenzimático Elisa para determinar lipoproteína (a)

Lic. Giovanna Pereira Roca, Lic. Arturo Reyes Durán y Téc. Mireya Adreu Arce

RESUMEN

El objetivo de nuestro trabajo fue desarrollar la metodología y la producción de los reactivos primarios para realizar un método inmunoenzimático (ELISA) tipo sandwich para determinar lipoproteína (a) en suero humano. La concentración final del antisuero policlonal antiapolipoproteína (a) (anti-apo [a]) obtenida fue de 1,3 mg/dL, purificado, por cromatografía de afinidad y de intercambio iónico. El antisuero antilipoproteína de baja densidad (anti LDL) de carnero purificado por cromatografía de afinidad fue utilizado en la obtención del conjugado policlonal peroxidasa-IgG anti-LDL. La concentración óptima de recubrimiento con anti-apo (a) fue de 2 mg/mL y la dilución óptima del conjugado fue 1/7000, con lo cual obtuvimos una sensibilidad alta del ensayo. Poder producir en nuestro laboratorio reactivos primarios para el desarrollo de un sistema inmunoenzimático de determinación de Lp (a) hace posible la accesibilidad de la determinación con fines asistenciales e investigativos, así como un ahorro en moneda libremente convertible, pues estos reactivos tienen un elevado costo en el mercado.

Descriptores DeCS: LIPOPROTEINA (A)/sangre; APOLIPOPROTEINAS A/ aislamiento y purificacion; APOLIPOPROTEINAS A/inmunologia; LIPOPROTEINAS LDL/aislamiento y purificacion; LIPOPROTEiNAS LDL/inmunologia; TEST DE ELISA/metodos; JUEGO DE REACTIVOS PARA DIAGNOSTICO; CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD; CROMATOGRAFIA POR INTERCAMBIO IONICO.

La composición lipídica de la lipoproteína (a) (Lp [a]) es similar a la de una lipoproteína de baja densidad (LDL), la partícula de Lp(a) se compone de una proteína apo B100 al igual que la LDL, pero contiene además una apolipoproteína adicional denominada apo (a), que está unida a la apo B100 a través de puentes disulfuro.1-3 El peso molecular de la Lp(a) es variable y los fenotipos observados pueden variar entre 200 y 700 KDa.4-6

Concentraciones de Lp (a) ³ 30 mg/dL han sido correlacionadas con enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares prematuras, especialmente cuando los niveles de LDL son elevados,7,8 de ahí el creciente interés de la medición de esta lipoproteína por varios laboratorios del mundo. En los últimos años ha habido un rápido desarrollo de inmunoensayos comerciales para determinar Lp(a) en suero o plasma humano.8,9 Un ensayo óptimo para determinar Lp(a) requiere de anticuerpos específicos, la reactividad cruzada de anticuerpos a apo(a) con el plasminógeno y el tamaño heterogéneo de las diversas isoformas de Lp(a) o apo(a) pueden causar problemas graves en la determinación cuantitativa de esta lipoproteína cuando se usan inmunoensayos.10-12 Para el estudio de la Lp(a) en nuestra población nos propusimos, en primera instancia, producir reactivos primarios como son: el antisuero policlonal anti apo (a) de conejo, y el conjugado anti-LDL de carnero para el desarrollo futuro de un método inmunoenzimático.

MÉTODOS

Obtención de reactivos primarios

AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE LA LP(a)

Aislamos la Lp(a) por ultracentrifugación secuenciada (en un rango de densidad de 1,05 - 1,12 g/mL ajustada con BrK) del suero de un donante cuya concentración de Lp(a) era de 72 mg/dL, el procedimiento desarrollado fue descrito por Redgrave y otros en 1975,13 y modificado por Morrisett y otros en 1987.9

Purificamos la Lp(a) aislada del suero por medio de una cromatografía rápida de exclusión molecular, utilizamos Superose 6 HR (10 mm/30 cm), el primer pico correspondió a la Lp (a) el cual verificamos por electroforesis e inmunodifusión en gel de agarosa, utilizamos los antisueros disponibles contra todas las apolipoproteínas.14

OBTENCIÓN, PURIFICACIÓN DEL ANTISUERO ANTI-APOLIPOPROTEÍNA (a)

Obtuvimos el antisuero específico para apo(a) en conejo, atendiendo a un esquema de inmunización para lipoproteínas reportado en la literatura,9 que utilizan como inmunógeno la Lp(a) humana purificada previamente en el laboratorio. El suero obtenido contiene anticuerpos contra apo(a), apo B100, y plasminógeno. Para preservarlo le añadimos 0,1 g/mL de azída sódica y 100 mL/mL de iniprol, ambos de la Pharma B.V Nederland. Por esta razón el suero necesita ser monoespecífico para apo(a) antes de poder utilizarlo en la determinación cualitativa o cuantitativa de la Lp(a).4

Para purificar el anti-apo(a) del anti-apo B100 y del resto de los componentes del suero realizamos una cromatografía de afinidad con Sepharosa 4B activada con bromuro de cianógeno (Pharmacia K16/90), la cual tiene acoplada LDL que constituye un inmunosorbente excelente para remover el anti-apo B.

Realizamos el paso final de purificación del anti-apo(a) por cromatografía de intercambio iónico, utilizamos un disco de QAEZETA PREP 15 (intercambiador aniónico), la IgG anti-apo(a) que eluye del disco la colectamos en fracciones de 3 mL y medida su densidad óptica a 280 nm. Determinamos la concentración final de IgG por densidad óptica (DO) a 280 y 340 nm en un espectrofotómetro LKB.

El antisuero fue alicuotado y conservado a 4 °C en caso de uso continuado y para almacenamiento a largo plazo a - 20 °C.

ELABORACIÓN DEL CONJUGADO IgG ANTI-LDL DE CARNERO

Purificamos el anti LDL de carnero a través de la cromatografía de afinidad, utilizamos la Sepharosa 4B activada con BrCN la cual tiene acoplada LDL, realizamos varias corridas hasta obtener 10 mg IgG en un volumen de 1 mL, dializamos contra tampón carbonato-bicarbonato de sodio 10 mM pH 9,5. Conjugamos el antisuero con (peroxidasa de rábano grado IRZ >30 Boehringer, HRPO) según el método del peryodato descrito por Tijssen en 1985.15 Disolvimos 2,5 mg de HRPO en 1 mL de NaHCO3 0,3 M y los mezclamos suavemente con 50 mL de una solución etanólica de DNFB 0,1 g/L (reactivo de Sanger). Después de 2 h de incubación a temperatura ambiente añadimos 0,5 mL de NaIO4 0,8 M para formar el aldehído peroxidasa. Detuvimos la reacción después de 1 h por adición de 0,1 mL de glicerol. La dializamos contra tampón de diálisis carbonato-bicarbonato 0,01 M pH 9,5 a 4 °C.

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN ÓPTIMA DE TRABAJO DEL ANTISUERO POLICLONAL IgG ANTI APO (a) DE CONEJO PARA SU UTILIZACIÓN EN EL ELISA

Recubrimos de poliestireno de 96 pozos, de la marca NUNC-IMMUNO MODULE, con 100 mL de antisuero policlonal anti apo(a) de conejo preparado a diferentes concentraciones, por dilución con tampón de recubrimiento, en un rango que comprendió 0,5;1;2;5 y 8 mg/mL. Distribuimos las diluciones del antisuero en filas de manera ascendente según el valor de concentración y, para determinar la concentración óptima de trabajo del antisuero, las enfrentamos con un conjugado comercial anti-LDL de la IMMUNO AG, durante el desarrollo de un ELISA tipo sandwich.12

Paralelamente, montamos un sistema de referencia comercial con antisuero monoclonal anti-apo(a) de conejo a una concentración de 5 mg/mL y un conjugado policlonal anti-LDL a una dilución de 1/25 000, ambos de la casa comercial IMMUNO AG.

En ambos casos utilizamos un estándar de referencia comercial de Lp(a) humana de concentración 68 mg/dL de la IMMUNO AG y preparamos por diluciones sucesivas, concentraciones de 2,2;4,3;8,5;17;34 y 68 ng/100 mL para el desarrollo de la curva estándar. Las densidades ópticas se leyeron a 492 nm en el espectrofotómetro fluorímetro SUMA.

TITULACIÓN DEL CONJUGADO POLICLONAL IgG ANTI-LDL DE CARNERO

La determinación de la dilución óptima de trabajo del conjugado fue realizada en condiciones similares a las del antisuero anti apo(a) de recubrimiento. Recubrimos las placas con 110 mL de antisuero monoclonal anti-apo(a) comercial de la IMMUNO AG una concentración de 5 mg/mL. El conjugado policlonal obtenido se preparó a diferentes diluciones desde 1/5 000 hasta 1/10 000, el volumen de conjugado empleado fue de 100 mL y lo distribuimos en columnas en la placa para el desarrollo del ELISA, paralelamente empleamos un conjugado policlonal peroxidasa-IgG anti-LDL comercial de la IMMUNO AG, utilizamos los mismos puntos de la curva estándar del ensayo anterior y la misma metodología en el desarrollo del ELISA. Leímos los valores de densidad óptica a 492 nm en el SUMA.12

RESULTADOS

Purificación del antisuero anti-Lp(a) de conejo

En el primer paso de purificación del anti-apo(a) de conejo a través de la cromatografía de afinidad, hallamos que la fracción anti-apo(a) de interés se encuentra en el eluato y queda retenida en el soporte fijo de la columna, la fracción anti-LDL. La concentración de la fracción IgG semipurificada la determinamos por densidad óptica a 280 y 340 nm y fue de 2,94 mg/dL.

Realizamos el segundo paso de purificación de la IgG anti-apo(a) mediante cromatografía de intercambio iónico, a las fracciones resultantes (3 mL/tubo), les determinamos la densidad óptica a 280 nm. Las fracciones fueron unidas y concentradas hasta un volumen de 3 mL, la concentración final de la IgG anti-apo(a) fue de 1,3 mg/mL, calculada por el método espectrofotométrico con lecturas a 280 y 340 nm.

Obtención del conjugado anti-LDL

En la figura 1 mostramos las curvas resultantes del proceso de conjugación de la IgG anti LDL con la enzima peroxidasa, como resultado de leer las fracciones colectadas a 280 y 403 nm. El primer pico a 403 nm identifica al complejo enzima peroxidasa IgG anti-LDL.
Figura 1
FIGURA 1. Purificación del conjugado mediante cromatografía Sephade G-100.

Determinación de la concentración óptima del antisuero policlonal anti-apo(a) de conejo, y titulación del conjugado policlonal anti-LDL de carnero

Las curvas patrones resultantes de plotear las densidades ópticas a 492 nm de las diferentes concentraciones del antisuero producido se observan en la figura 2, la concentración óptima de trabajo del antisuero fue de 2 mg/mL.

Figura 2
FIGURA 2. Concentración óptima del antisuero policlonal anti apo(a) de conejo.

La figura 3 refleja el comportamiento de nuestro conjugado policlonal anti-LDL de carnero a las diferentes diluciones de trabajo. La dilución óptima de trabajo del conjugado fue de 1/7 000.

Figura 3
FIGURA 3. Títulación del conjugado.

DISCUSIÓN

Resulta notable el incremento experimentado en los años recientes en el número de investigaciones clínicas y epidemiológicas de la Lp (a) como factor de riesgo de la aterosclerosis. La disponibilidad de métodos inmunológicos estandarizados para cuantificar esta lipoproteína se reconoce hoy día como necesidad, pues a pesar de los esfuerzos realizados por diversos investigadores, este no es un asunto totalmente resuelto.

La reactividad cruzada de anticuerpo a apo(a) con el plasminógeno y el tamaño heterogéneo de las diversas isoformas de Lp(a) o apo(a), pueden causar problemas graves en la determinación cuantitativa de esta lipoproteína cuando se usan immunoensayos.

En nuestro país son pocos los laboratorios que cuentan con métodos y medios para cuantificar Lp(a), de ahí nuestro interés en desarrollar métodos y producir reactivos primarios que hagan posible la accesibilidad de su determinación.

Los resultados que presentamos anteriormente avalan la calidad analítica del antisuero policlonal antiapo(a) purificado en 2 pasos, por cromatografía de afinidad y por intercambio iónico. La concentración óptima seleccionada del antisuero garantiza los mayores valores de absorvancia para las diferentes diluciones del estándar, a este valor de concentración del antisuero los valores de densidad óptica se desplazan en un rango muy próximo a los obtenidos en el sistema de referencia comercial, a partir de 2 mg/mL la respuesta específica del antisuero tiende a decrecer a medida que se incrementa la concentración de éste en la placa, lo cual nos permite afirmar que esa concentración del antisuero es la idónea para el desarrollo del ELISA tipo sandwich.

Con la dilución óptima del conjugado seleccionada logramos una buena combinación de una alta sensibilidad y una respuesta mínima a concentración cero de la Lp(a) que estamos cuantificando, también con esta dilución del conjugado se logra un incremento en los valores de densidad óptica correspondientes a los últimos puntos de nuestra curva estándar, lo cual nos permite obtener una mayor similitud entre ésta y la curva estándar de referencia.

Poder producir en nuestro laboratorio los reactivos primarios para el desarrollo de un sistema inmunoenzimático (ELISA) tipo sandwich para cuantificar Lp(a) sérica hace posible la accesibilidad de la determinación con fines asistenciales e investigativos en nuestra red de salud, así como un ahorro en moneda libremente convertible, pues estos reactivos comerciales tienen un costo elevado en el mercado.

SUMMARY

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Recibido: 9 de octubre de 1996. Aprobado: 8 de enero de 1997.

Lic. Giovanna Pereira Roca. Instituto Nacional de Endocrinología, Zapata y C, El Vedado, Ciudad de La Habana, Cuba. CP 10 400.

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