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Revista Cubana de Enfermería, septiembre-diciembre, 1995
Empresa de Productos Biológicos "Carlos J. Finlay"

Empleo de la inmunodifusión radial simple en la evaluación de vacuna DPT de producción nacional

Lic. Leonor Enríquez,<1> Lic. Clara Parra,<2> Lic. Míriam Díaz<3> y Esp. Xenia Muñoz<4>

RESUMEN

Se describe el método de obtención de la vacuna DPT, desarrollada por primera vez en Cuba, y se expresan los resultados de las pruebas químicas y biológicas realizadas a 7 lotes de vacuna final. Se comprueba la eficiencia de la técnica de inmunodifusión radial simple para la prueba de identidad, y se compara con la prueba de floculación para la determinación de las concentraciones de los toxoides diftéricos y tetánicos presentes en la vacuna.

Palabras clave: VACUNA DIFTERIA-TETANO-PERTUSSIS/química; TESTS DE DIFUSION EN GEL/métodos.

INTRODUCCION

La vacuna DPT se utiliza para la inmunización de niños de 3 a 5 meses, con el fin de prevenirles de enfermedades, tales como: la difteria, el tétanos y la tos ferina.

Los 3 componentes antigénicos que forman la vacuna se mezclaron en las proporciones adecuadas, y de esta forma se obtuvieron 7 lotes de vacuna final, los cuales en sus envases definitivos se sometieron a las pruebas de control establecidas.1

Con el fin de comprobar los resultados en el caso de la identificación de los toxoides tetánicos y diftéricos, basados en las pruebas de floculación, ensayamos el uso de la técnica de inmunodifusión radial simple,2 en gel de agarosa, en la que se identificaron los toxoides por bandas de precipitación visibles.

Este método es cuantitativo y se encontró estabilidad en los valores de los toxoides presentes en los 7 lotes de vacuna probadas, para el caso del diftérico; sin embargo, en el caso del tetánico, los resultados fueron un poco más bajos que el incorporado en la vacuna.

MATERIAL Y METODO

PREPARACION DE LA VACUNA

Se prepararon 7 lotes de vacuna triple (DPT) con toxoide tetánico purificado estéril a una concentración de 20 unidades (UB/mL), toxoide diftérico purificado estéril con una concentración de 60 unidades (Lf/mL), vacuna B. pertussis con una concentración de 26 UO/mL, hidróxido de aluminio (Alhydrogel) como adyuvante a una concentración de 2 mg/mL y como preservo timerosal 1 g en 10 000 mL.

La vacuna se preparó3 añadiendo el gel en la concentración deseada en un vaso de agitación, se esterilizó a 110 &middot;C durante 30 min, y se tomaron muestras posteriores para pureza, velocidad de sedimentación y pH.

A las 24 h se comenzó a añadir el toxoide diftérico y tetánico, mediante agitación constante por 2 h. Posteriormente se le adicionó lentamente la suspensión de B. pertussis, dividiendo la cantidad a adicionar para lograr una completa mezcla de los toxoides con la suspensión bacteriana. Finalmente, se agregó la solución de timerosal, previamente esterilizada por filtración.

La mezcla final permaneció en agitación hasta el día siguiente, y se tomaron las muestras para las pruebas de control del proceso.

PRUEBAS DE CONTROL

A todos los lotes preparados se les realizaron las pruebas siguentes, según la Norma Cubana 26-45:83.4 La prueba de esterilidad se realizó según la Norma Cubana 26-12:81.

Para la prueba de identidad de la vacuna B. pertussis, se realizó una aglutinación con antisueros específicos de factores 1, 2 y 3.5

En el caso de los toxoides se utilizó como ensayo cuantitativo la inmunodifusión radial simple, y se compararon los resultados con la técnica establecida de floculación de Ramón.6

La técnica de inmunodifusión radial simple se realizó según lo descrito por Mancini,7 para lo cual se tomaron como referencias: el toxoide tetánico purificado estéril 5-88 y el toxoide diftérico purificado estéril 2-79 de la Empresa de Productos Biológicos "Carlos J. Finlay", a los cuales se les hicieron diferentes diluciones y quedaron las siguientes concentraciones: 5, 10, 20, 30 y 40 Lf/mL para el primer componente y 15, 30, 60, 100 y 140 Lf/mL para el segundo.

Las muestras de vacuna DPT se trataron con citrato trisódico a una concentración de 10 % m/v durante 16 h a 37 &middot;C, con el fin de separar los toxoides de la B. pertussis y del adyuvante. El sobrenadante de la precipitación contenía los toxoides tetánicos y diftéricos, a los cuales se les hicieron diluciones y quedaron las siguientes concentraciones: 5, 10, 15 y 20 Lf/mL para el toxoide tetánico y 10, 20, 30, 50 y 60 Lf/mL para el toxoide diftérico.

Las placas para el montaje de la inmunodifusión se prepararon con agarosa al 1 % en PBS, mezclada con la antitoxina (100 UI/mL) a una concentración de 3,3 % v/v. Los pozuelos se cortaron con un diámetro de 3 mm y a una distancia de 10 mm uno de otro.

Después de la corrida, las placas se tiñeron con amido negro, y se observaron los halos de precipitación correspondientes.

El cálculo de las concentraciones de cada pozuelo se realizó mediante extrapolación en una curva patrón de los toxoides de referencia, donde se ploteó al diámetro del halo de precipitación contra la concentración de los toxoides.

RESULTADOS Y DISCUSION

En las tablas 1 y 2 se observa que las pruebas químicas y biológicas realizadas a los 7 lotes de vacuna DPT fueron satisfactorias.

La figura 1 muestra los resultados obtenidos en la prueba de inmunodifusión radial simple para la prueba de identidad del toxoide diftérico; se observan los halos de precipitación correspondientes a los toxoides diftéricos de referencia y a los toxoides de los diferentes lotes, enfrentados todos a antitoxina diftérica.

En la figura 2 se presentan los halos de precipitación obtenidos en la inmunodifusión radial simple para el toxoide tetánico, realizado de forma similar al toxoide diftérico; se obtuvieron resultados satisfactorios, aunque los valores fueron más bajos, tanto para los toxoides de referencia, como para las muestras.

En la tabla 3 se comparan los valores obtenidos de los toxoides tetánicos y diftéricos, según cálculos mediante la curva patrón obtenida en la prueba de inmunodifusión radial simple y los obtenidos en la prueba de floculación realizada a los lotes; se demuestra que ambas pruebas se corresponden.

CONCLUSIONES

  1. Las pruebas de control de la calidad fueron satisfactorias dentro de los rangos de aceptación establecidos por la Organización Mundial de la Salud para esta vacuna.
  2. Los valores obtenidos en la curva para los toxoides tetánicos y diftéricos, en la técnica de inmunodifusión radial simple, son comparables con los valores de floculación.
  3. La prueba de inmunodifusión radial simple empleada, es un método rápido, sencillo y confiable para la cuantificación de los toxoides diftéricos y tetánicos, y puede ser propuesto como un método alternativo para este propósito.

AGRADECIMIENTOS

Deseamos agradecer la colaboración en la realización de este trabajo a los compañeros Adelfa Morales, Angela Morales y Ricardo Quintero del área de investigación de nuestra empresa.

<1>Licenciada en Microbiología. Investigadora Agregada.

<2>Licenciada en Microbiología.

<3>Licenciada en Farmacia. Investigadora Agregada.

<4>Especialista en Control de Biológicos.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

  1. Comité de Expertos de la OMS en Patrones 30. Informe. Ginebra: OMS, 1979:117. (Serie Informes Técnicos).
  2. Winsnes R, Mogster B. The identification of diphteria, tetanus and pertussis vaccines by simple radial and double immunodiffusion techniques. J Biol Stand 1985;13:34.
  3. World Health Organization. Requirements for diphteria toxoid, pertussis vaccine, tetanus toxoid and combined vaccines. World Health Organ. Tech Rep Ser 1979;638.
  4. NC 26-45. Norma Cubana de Medicamentos: toxoide tetánico adsorbido: especificaciones de calidad.
  5. Field LH. Differences observed between fresh isolates of Bordetella Pertussis and their laboratory passaged derivates. New York: International Symposium or pertussis, 1978.
  6. Ramón G. Flocculation dans un mélage neutre de toxine antitoxine d. phtériques. Comptemp Rend Soc Biol 1982;86:661.
  7. Mancini G, Carbonara AO, Heremans JF. Immunochemical quantitation of antigens by single radial immunodiffusion. Immunochemistry 1985;2:235-54.
Recibido: 7 de febrero de 1994. Aprobado: 14 de abril de 1994.

Lic. Leonor Enríquez. Empresa de Productos Biológicos "Carlos J. Finlay". Infanta No. 1162, municipio Centro Habana, Ciudad de La Habana 10300, Cuba.

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