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Rev Cubana Farm 2003; 37(3)

Artículos Originales

Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos

Validación de un ciclo de despirogenización por calor seco con el empleo del ensayo del lisado de amebocitos de limulus

Rolando Perdomo Morales1 y Vivian Montero Alejo2

Resumen

Para el cumplimiento de las buenas prácticas de laboratorio y de fabricación de parenterales, una de las exigencias es la validación de los ciclos de despirogenización que se emplean. En el presente trabajo se describe la validación de un ciclo de despirogenización por calor seco en un horno de convección. En la primera etapa se estudiaron características físicas del equipo como el tiempo requerido para alcanzar la temperatura establecida, su distribución, estabilidad, y la influencia de la carga en el patrón de calentamiento. Considerando los resultados de esta fase se estableció un proceso total de 7 h a 180 ºC. La segunda etapa consistió en la determinación del grado de despirogenización retando el proceso con bioindicadores de endotoxinas. La concentración de endotoxinas en los bioindicadores control y sometidos al proceso de despirogenización se cuantificó con el empleo del ensayo del lisado de amebocitos de limulus método de gelificación. La diferencia entre el contenido de endotoxinas en el control y los tratamientos fue de 2 400 U de endotoxinas, por lo que el proceso rindió una reducción logarítmica mínima de 4,6 log, la cual es mayor que el límite de 3 log establecido por la Farmacopea de los Estados Unidos.

DeCS: ENDOTOXINAS; GRADO DE CONCENTRACION; TEST DE LIMULUS.

El acceso de las endotoxinas bacterianas a la circulación sanguínea provoca una miríada de profundas repuestas fisiológicas, en su mayoría de carácter perjudicial para la salud humana. Las endotoxinas bacterianas o pirógenos (que inducen fiebre), son lipopolisacáridos (LPS) que se localizan exclusivamente en la membrana externa de las bacterias gramnegativas y poseen una alta potencia que se conserva aun después de la muerte de la bacteria.1 Los fabricantes de productos farmacéuticos parenterales y de accesorios médicos que tendrán contacto con la circulación sistémica, son responsables de asegurar que sus productos estén libres de pirógenos.

El proceso de despirogenización se define como la eliminación de todas las sustancias pirogénicas incluyendo las endotoxinas bacterianas, y se logra generalmente por separación o inactivación.2 Las endotoxinas bacterianas constituyen el pirógeno más significativo y en la mayoría de las situaciones el más resistente. Puesto que las condiciones requeridas para la destrucción de endotoxinas destruirán otros pirógenos, en este tipo de estudios se acepta el término despirogenización en su generalización.3

El método clásico y más efectivo para la despirogenización de materiales termorresistentes es mediante la aplicación de calor seco en hornos y túneles de convección, conducción o radiación (infrarrojo). Clasifica entre los métodos de inactivación y se fundamenta en la destrucción térmica de las endotoxinas por incineración.4

El ciclo de despirogenización estándar es de no menos de 250 ºC por 30 min y se basa en los estudios de Welch y otros a principios de la década de los 40, quien empleó el ensayo de pirógenos en conejos para evaluar la termoestabilidad de las endotoxinas.1,2 Sin embargo, se han descrito otros ciclos como por ejemplo 180 ºC por 4 h,1,5 250 ºC por 1 h,6 190 ºC por 4 h,7 y 250 ºC por 4 h.8 Estudios de Tsuji y Harrison9 acerca de la cinética de inactivación de las endotoxinas por calor seco, demostraron que por debajo de 180 ºC la despirogenización puede ser incompleta incluso después de largos períodos.

Para el estudio de los procesos de despirogenización por calor seco muchos autores han decidido importar parámetros de la validación de los procesos de esterilización; sin embargo, a diferencia con la despirogenización la temperatura y el tiempo de estos procesos son menores, además, la cinética de destrucción de los microorganismos es bastante diferente a la de las endotoxinas.10

Tsuji y Lewis11 propusieron un modelo matemático para la evaluación del proceso de inactivación de las endotoxinas por calor seco. Aunque estos resultados son prometedores, aún no están tan bien definidos como los modelos que describen la esterilización. Actualmente, la mayoría de la industria emplea un acercamiento más directo, donde la inactivación o destrucción de retos de endotoxinas se demuestra empíricamente.12

La Farmacopea de los Estados Unidos en su edición 24,13 recomienda que se incluyan retos de endotoxinas en cualquier proceso que pretenda producir artículos libres de pirógenos por calor seco. Además, especifica que dicho proceso debe demostrar una reducción de al menos 3 logaritmos en la diferencia entre el nivel recuperable de endotoxinas (control), el cual debe ser de al menos 1 000 unidades de endotoxinas (UE), y la endotoxina residual (tratamientos). Establece que los niveles de endotoxinas tienen que ser determinados con el empleo del ensayo del lisado de amebocitos de limulus (LAL).

La Farmacopea de los Estados Unidos, la Europea o la Británica, por ejemplo, no describen la metodología para realizar la validación de un proceso de despirogenización por calor seco, incluso, no se refieren los otros métodos que existen. Por otra parte, la Asociación para Drogas Parenterales (Parenteral Drug Association, PDA) expone en los reportes técnicos No. 314 y No. 715 algunos aspectos a tener en cuenta a la hora de elaborar un protocolo de validación. En la literatura científica se pueden encontrar algunos trabajos que tratan este tema y podrían ayudar al buen diseño de una estrategia.3,4,10,12 ,16

El objetivo del presente trabajo es la validación de un procedimiento de despirogenización por calor seco en un horno de convección sin recirculación de aire empleado para la preparación de cristalería de laboratorio libre de pirógenos.

Métodos

Evaluación de las características físicas del horno. Fase I. El estudio se realizó por método en batch en un horno de convección sin recirculación de aire. Durante el tiempo de ensayo la temperatura se registró empleando un termómetro de laboratorio en el centro del nivel inferior del horno y otro que ocupó la zona central superior.

El ciclo de despirogenización estudiado fue de 4 h a una temperatura de 180 ºC,1,5 y se dejó un margen de seguridad de aproximadamente 7 ºC por encima. Para determinar el tiempo necesario en alcanzar la temperatura, su estabilidad y homogeneidad se registró la temperatura en ambas zonas cada 15 min y se construyó un gráfico de temperatura contra tiempo (patrón de temperatura) con el empleo del programa Microcal Origin versión 5.0.

La influencia de la carga en el tiempo y capacidad del horno para alcanzar la temperatura establecida, se determinó mediante la comparación del patrón de temperatura de la zona fría del horno vacío con su patrón en el peor caso, lo cual significa ocupar completamente la cámara con el material que usualmente será sometido al proceso de despirogenización.3

Reto del ciclo de despirogenización con bioindicadores de endotoxinas. Fase II. Para determinar el grado de despirogenización se retó el ciclo con un juego de bioindicadores de endotoxina (ECVÔ), BioWhittaker. Cada vial contenía más de 1 000 UE.

El procedimiento se basó en las estrategias propuestas por Dawson.3 Se colocaron 10 bioindicadores siguiendo un patrón en X en cada nivel de la estufa en condiciones del peor caso. En paralelo, se dejó un vial de bioindicador control que no fue sometido al tratamiento. Una vez concluido el ciclo y que los bioindicadores tratados alcanzaran la temperatura ambiente, se procedió a la extracción de endotoxinas reconstituyendo los viales tratados y control con 1 mL de agua libre de endotoxinas, se cubrió el vial con papel parafilm y se aplicó agitación vigorosa con Vortex por 1 min cada 10 min durante 1 h.

Determinación de la concentración de endotoxinas por el método del LAL y de la reducción logarítmica obtenida en el ciclo de despirogenización estudiado
. La concentración de endotoxinas se determinó con el empleo del juego de reactivos PyrogentplusÒ, método de gelificación con una sensibilidad (l) de 0,06 UE/mL, según la guía del fabricante y la guía directiva de la Administración de Alimentos y Drogas de los Estados Unidos (FDA) para la validación y ensayo de rutina del método del LAL.17

Básicamente, el ensayo consistió en la reacción de 0,1 mL de muestra o estándar en un tubo de vidrio sódico cálcico de 10 x 75 mm libre de endotoxinas con 0,1 mL de reactivo LAL. La mezcla de reacción se incubó por 60 min a 37 ºC en un calentador de bloque seco. Al cabo de este tiempo se leyó el ensayo mediante la inversión cuidadosa de los tubos de reacción en un ángulo de 180 º. La formación de un gel consistente que resistió la inversión del tubo de ensayo fue registrado como respuesta positiva. La curva patrón para confirmar la sensibilidad establecida por el fabricante (4 réplicas) y para la corrida del método (2 réplicas) se desarrolló a concentraciones de 0,015; 0,03; 0,06 y 0,12 UE/mL del estándar secundario de endotoxinas suministrado con el juego de reactivos LAL.

Para la cuantificación de endotoxinas en los bioindicadores se desarrolló una serie de 4 diluciones dobles de las muestras en paralelo. Para los bioindicadores tratados se partió directamente del extracto, mientras que para el control se desarrolló a partir de una dilución 1:10 000 obtenida por serie de diluciones 10 x del extracto. Siempre se agitó vigorosamente con Vortex por 30 s entre cada paso de dilución.

La concentración de endotoxinas en las muestras se obtuvo multiplicando la sensibilidad del ensayo por la media geométrica de los puntos finales, que es la última dilución positiva para cada réplica.

La reducción logarítmica del contenido de endotoxinas se calculó restando al logaritmo de la cantidad de endotoxinas obtenida en el control (UE/vial), el logaritmo de la cantidad de endotoxinas en el vial tratado. Una reacción negativa en el extracto sin diluir indica una concentración menor que 0,06 UE/mL, y se empleó este valor para determinar la reducción logarítmica mínima.

Resultados

A partir de los patrones de temperatura correspondientes a las zonas superior e inferior de la cámara (fig. 1), se observó una diferencia promedio entre ambas zonas de 4-5 ºC en la etapa de calentamiento, mientras que en la fase de meseta la temperatura se mantuvo muy estable y homogénea con una diferencia de 2 ºC. Sin embargo, fueron necesarios 30 min adicionales para que la zona superior alcanzara los 180 ºC (tabla 1).


FIG. 1. Patrones de temperatura de las zonas inferior y superior de la cámara vacía.

TABLA 1. Tiempo para alcanzar la temperatura establecida en 2 zonas de la estufa con la cámara vacía

Ensayo

Tiempo para estabilizar a la temperatura establecida (h:m)
Zona superior
2:15
Zona inferior
1:45

En la figura 2 se puede observar que la carga influyó en la cinética de calentamiento pero no en la capacidad del equipo para alcanzar la temperatura establecida en la zona fría, para lo cual se requirieron 45 min adicionales (tabla 2).

FIG. 2. Efecto de la carga en los patrones de temperatura en la zona fría de la estufa.

TABLA 2. Influencia de la carga en el tiempo para alcanzar la temperatura establecida en la zona fría (superior)

Ensayo
Tiempo para estabilizar a la temperatura fijada (h:min)
Horno cargado
3:00
Horno sin carga
2:15

En los ensayos para la calificación inicial del laboratorio/analista y verificación de la sensibilidad establecida por el fabricante de reactivo LAL, el punto final de todas las réplicas correspondió a una concentración del estándar de endotoxinas de 0,06 UE/mL (tabla 3).

TABLA 3. Calificación inicial del laboratorio/analista y confirmación de la sensibilidad del método del LAL establecida por el fabricante

Curvas
Curva patrón
Concentración de la endotoxina estándar (UE/mL)
0,015
0,03
0,06
0,12
Réplica 1
-
-
-
-
-
+
+
+
Réplica 2
-
-
-
-
-
+
+
+
Réplica 3
-
-
-
-
-
+
+
+
Réplica 4
-
-
-
-
-
+
+
+

          Gelificación: Positiva (+) cuando el gel formado resiste la inversión cuidadosa del tubo de ensayo un ángulo de 180 º,           cualquier otra condición es reportada como negativa (-).

En la tabla 4 se resumen los resultados obtenidos en el ensayo del LAL, la concentración de endotoxinas obtenida y la reducción logarítmica mínima por vial. En todos los viales tratados se obtiene una concentración menor que 0,06 UE, mientras que el control contiene 2 400 UE.

TABLA 4. Determinación de la potencia por el ensayo del LAL en los bioindicadores y estimación de la reducción logarítmica mínima por vial

Diluciones
Bioindicadores
Vial 1
Vial 2
Vial 3
Vial 4
Vial 5
Vial 6
Vial 7
Vial 8
Vial 9
Vial 10
Control

Sin diluir
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
1:2
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
1:4
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
1:8
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Concentración final de endotoxinas por vial
Conc.UE/mL < 0,06 < 0,06 < 0,06 < 0,06 < 0,06 < 0,06 < 0,06 < 0,06 < 0,06 < 0,06 2 400
Reducción logarítmica mínima 4,6 4,6 4,6 4,6 4,6 4,6 4,6 4,6 4,6 4,6 -

Discusión

La temperatura no se distribuye de manera uniforme en la cámara de la estufa, se requiere mayor tiempo para alcanzar la temperatura establecida en la zona superior por lo cual es identificada como la zona fría. Este comportamiento es debido a que la resistencia de la estufa se encuentra en la parte inferior, además, un sistema sin recirculación de aire provoca cierto retardo en la homogeneización de la temperatura en la cámara por el mecanismo transferencia de calor por convección. Este comportamiento se ha descrito por Avis,18 quien demostró que existen considerables variaciones en la velocidad de calentamiento y en la temperatura alcanzada en distintos puntos del horno. Además, observó notables fluctuaciones de estos parámetros entre corridas, cuando supuestamente la estufa operaba en las mismas condiciones. Este comportamiento que él describe fue bastante similar entre un horno de convección y uno de radiaciones.

Por otra parte, Gail y Jensch,19 observaron una diferencia de 3 ºC entre ámpulas y de 10-15 ºC con respecto a la temperatura del aire en un túnel de esterilización operando a 256 ºC. Esta diferencia fue menos notable a más bajas temperaturas. Considerando lo planteado en que no se contó con los accesorios necesarios para determinar con precisión el punto frío del horno, y que a menos de 180 ºC la despirogenización puede ser incompleta, es que se añadió un factor de seguridad de 7 ºC en la temperatura. Podrían plantearse otras estrategias como, por ejemplo, trabajar con ciclos de mayor temperatura y/o establecer mayor tiempo.

Con el compendio de los resultados obtenidos en esta fase, se define un ciclo de despirogenización de 7 h a 187 ºC, de las cuales las 3 primeras horas cubren el tiempo necesario para que se alcance la temperatura de despirogenización establecida en la zona más fría del horno en condiciones del peor caso.

Para la cuantificación de endotoxinas en cualquier muestra por el método del LAL, primeramente hay que validar el método que se emplea en dicha muestra. La metodología para la validación del método del LAL, solo se define para garantizar que se cuantifica de manera confiable la endotoxina presente en una muestra determinada.20

La guía directiva de la FDA17 y la Farmacopea de los Estados Unidos en su edición 24,13 recomiendan 2 pasos para la validación del método del LAL. Uno de ellos estriba en la evaluación del grado de inhibición que provoca determinada muestra o dilución de la muestra frente al reactivo LAL. Sin embargo, se ha planteado en la literatura que a diferencia de la manipulación necesaria para cuantificar endotoxinas en muchos productos farmacéuticos inhibidores del reactivo, los bioindicadores de endotoxinas emplean agua libre de endotoxinas (no inhibitoria), lo cual hace que no se requieran de tratamientos especiales para dichas muestras.2 Por lo tanto, no se realizó control positivo de producto para valorar el grado de inhibición en las diluciones evaluadas.

Los resultados de la segunda fase de la validación del método LAL (tabla 3) confirman la sensibilidad establecida por el fabricante del juego de reactivos y, por lo tanto, demuestran que el procedimiento y las condiciones empleadas para la corrida del método fueron adecuados, lo cual asegura la cuantificación confiable de las endotoxinas presentes en las muestras.

Uno de los aspectos más discutidos en la literatura ha sido el recobro de endotoxina. Se ha descrito que este depende fundamentalmente de las características del recipiente (tipo de cristal o plástico), el método para fijar o secar las endotoxinas y del método de extracción.2,3,10 En nuestro trabajo se utilizaron bioindicadores comerciales que no especifican con exactitud la potencia de la endotoxina contenida, ni proponen un método para realizar la extracción. Por lo tanto, no es posible determinar los porcentajes de recobro obtenidos con el método empleado. Sin embargo, como se obtuvo un recobro de 2 400 UE en el control, el método es adecuado para desarrollar la extracción de endotoxinas pues permite la recuperación de más de 1 000 UE/vial y determinar una reducción logarítmica de más de 3 log, aun si se empleara el método LAL menos sensible (0,12 UE/mL) con este lote de bioindicadores.


El ciclo de despirogenización estudiado produjo una reducción logarítmica mínima de 4,6 log o de 40 000 veces la potencia del control, demostrando una mayor reducción que el mínimo establecido por la Farmacopea de los Estados Unidos.13

Recomendaciones

Emplear termisores o termopares en viales bajo condiciones de máxima carga e identificar el punto frío. Determinar el tiempo requerido para alcanzar la temperatura deseada en este punto, lo cual definirá el tiempo total del ciclo con mayor precisión.

Summary

To fullfill the good laboratory and parenteral drugs manufacturing practices, one of the demands is the validation of the depyrogenation cycles that are used. In this paper, it is described the validation of a depyrogenation cycle by dry heat in a convection oven. The physical features of the equipment, such as the time required to reach the established temperature, its distribution, stability, and the influence of the charge on the heating pattern, were studied in the first stage. Taking into account the results of this phase, it was established a total process of 7 h at 180 °C. The second stage consisted in the determination of the degreee of depyrogenation, challenging the process with endotoxin bioindicators. The concentration of biotoxins in the control bioindicators, which were subjected to the depyrogenation process, was quantified by using the limulus amoebocytes flattening by gelification method.. The difference between the content of endotoxins in the control and the treatments was 2 400 U of endotoxins. That's why, the process yielded a minimum logarithmic reduction of 4.6 log that is higher that the limit of 3 log established by the US Pharmacopoeia.

Subject headings: ENDOTOXINS; DENSITY FACTOR; LIMULUS TEST.

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Recibido: 25 de abril de 2003. Aprobado: 29 de mayo de 2003.
Lic. Rolando Perdomo Morales. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). Ave. 26 No. 1605 entre Boyeros y Puentes Grandes, municipio Plaza de la Revolución, CP 10600, Ciudad de La Habana, Cuba. E-mail: cidem@infomed.sld.cu

1Licenciado en Bioquímica.
2Licenciada en Ciencias Farmacéuticas.

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