ARTÍCULO ORIGINAL

 

Determinación in vitro del Factor de Protección Solar del Gel Fotoprotector Epidérmico mediante la espectrofotometría

 

In vitro determination of the Sun Protection Factor of the Gel Fotoprotector Epidérmico by ultraviolet espectrophotometry

 

 

Maydelin Trujillo Alfonso, Efreín Lauzán Álvarez, Yadira González Herrera

Centro de Histoterápia Placentaria, La Habana, Cuba.

 

 


RESUMEN

Introducción: Los fotoprotectores de uso tópico son agentes que tienen la finalidad de proteger la estructura y preservar la función de la piel humana contra el daño actínico. El Gel Fotoprotector Epidérmico forma parte de la Línea de Amnioterapia Cosmética desarrollada por investigadores del Centro de Histoterapia Placentaria a partir del cordón umbilical humano.
Objetivo : Determinar in vitro el factor de protección solar del Gel Fotoprotector Epidérmico a través de la espectrofotometría ultravioleta.
Métodos: Para el cálculo del factor de protección solar se utilizó la ecuación de Mansur y se evaluó la precisión del método mediante repetibilidad y precisión intermedia.
Resultados: El factor de protección solar obtenido fue de 11.10 ± 0.02. La variabilidad de los resultados cumple con los límites establecidos. Los coeficientes de variación inter e intraensayo fueron adecuados y no existieron diferencias significativas entre las precisiones y las medias alcanzadas por los analistas en diferentes días con un 95 % de confianza.
Conclusiones: El Gel Fotoprotector Epidérmico ofrece una baja protección solar contra las radiaciones UVB, este estudio permitió enriquecer su registro sanitario y sienta las bases para desarrollar nuevas generaciones que incrementen su espectro de absorción contra las radiaciones solares.

Palabras clave: radiaciones solares, factor de protección solar, espectrofotometría ultravioleta.


ABSTRACT

Introduction: The topical sunscreens are agents that have the purpose to protect the structure and to preserve the function of the human skin against the actinic damage. The Gel Fotoprotector Epidérmico (sunscreen) is part of the Cosmetic Amniotherapy developed by research of Placental Histotherapy Center obtained from the human umbilical cord.
Objective: To determine in vitro the sun protection factor of the Gel Fotoprotector Epidérmico (sunscreen) through the ultraviolet espectrophotometry.
Methods: For the calculation of the sun protection factor the equation of Mansur was used and the precision of the method was evaluated by means of repeatibility and intermediate precision.
Results: The sun protection factor obtained was 11.10 ± 0.02. The variability of the results fulfills the established limits. The variation coefficients intrassay and interassay was appropriate and significant differences didn't exist among the precisions and the mean reached by the analysts in different days with 95 % of trust.
Conclusions: The Gel Fotoprotector Epidérmico (sunscreen) offers low protection against UVB solar radiation. This study allowed enriching the sanitary registration of the sunscreen and contributes to develop new generations that increase its protection spectrum against the solar radiations.

Keywords: solar radiations, sun protection factor, ultraviolet espectrophotometry.


 

 

INTRODUCCIÓN

El sol emite radiación ultravioleta (UV) en un rango de longitud de onda de 100-400nm, que se clasifica en UVC (100-290 nm), UVB (290-320 nm), UVA (320-400nm). Esta última se divide en UVA I o cortos (320-340 nm) y UVA II o largos (340-400nm).1,2

La luz solar produce daño cutáneo porque los fotones de las radiaciones ultravioletas son absorbidos por el ADN, ARN, proteínas, lípidos de la membrana y orgánulos celulares presentes en la epidermis y dermis, incluyendo el sistema vascular.2 Los efectos de la radiación UV son dosis-dependientes y acumulativos, las quemaduras solares, la fotosensibilidad, las fotodermatosis, la inmunodepresión, el fotoenvejecimiento y la fotocarcinogénesis son algunos de los efectos adversos más relevantes.3

Los fotoprotectores de uso tópico contienen moléculas o complejos moleculares que pueden absorber, reflejar o dispersar fotones de radiación UV.4 El Dr. Carlos Miyares Cao y colaboradores del Centro de Histoterapia Placentaria desarrollaron una formulación con extracto hidroalcohólico de cordones umbilicales de la placenta humana (EC -30) el cual tiene efecto bronceador y fotoprotector. Este producto forma parte de la Línea de Amnioterapia Cosmética con dos denominaciones: Gel Fotoprotector Epidérmico y Protector Solar. Si bien se realizaron estudios farmacológicos que mostraron su actividad biológica,5 en estos momentos no se conoce exactamente el factor de protección solar que ofrece este producto.

El factor de protección de solar (FPS) indica el número de veces que el fotoprotector aumenta la capacidad de defensa natural de la piel frente al eritema; es decir, es un índice que ayuda a determinar el tiempo en que se puede permanecer bajo el sol sin sufrir una quemadura 3. La definición actual de la mayoría de los trabajos parte de los aportes realizados por Schutlze en 1956. Este autor lo define como el "cociente entre la mínima cantidad de energía necesaria para producir eritema mínimamente detectable (Dosis mínima de Eritema: MED) en piel con fotoprotección y la energía requerida para producir MED sin la aplicación de fotoprotector", a las 24 h de irradiación.6

Existe una literatura abundante sobre los métodos para la determinación del FPS. El método a desarrollar depende esencialmente del tipo de fotoprotector; o sea, de los filtros solares que este tenga. Los ensayos para evaluar protección frente a la radiación UVB son test biológicos in vivo. Los más utilizados son el de la Food and Drug Administration americana, el AS/NZ 2604 australiano y el COLIPA de la Unión Europea, y para la protección UVA los test in vivo que incluyen el oscurecimiento inmediato de pigmento (IPD), de pigmentación persistente (PPD) y el factor de protección UVA (PFA o APF). De los métodos in vitro destaca la determinación de longitud de onda crítica.7-12

De acuerdo a las regulaciones vigentes, la comprobación del FPS debe ser in vivo. No obstante, estos métodos son muy complejos, costosos y se necesita una tecnología que no está disponible en nuestro país.3,8,9,11 En contrapartida se ha reportado la utilización de un método in vitro que posee como ventaja su reproducibilidad, bajo costo, fácil metodología y rapidez en la obtención de los resultados. Este método desarrollado por Mansur y colaboradores13 está recomendado para ser utilizado en la fase de desarrollo de formulaciones y como rutina en el control de calidad de los protectores solares.

A través de una ecuación matemática se realiza el cálculo del FPS por espectrofotometría, midiendo la absorbancia del filtro o del protector solar en la región del UVB en un rango de longitud de onda de 290-320 nm. Esta metodología es una propuesta a desarrollar antes de realizar pruebas en seres humanos. Se ha reportado que es posible trazar una correlación entre el resultado obtenido con este test y los obtenidos por los métodos in vivo.14 Este procedimiento ha sido empleado por diferentes investigadores para el cálculo del FPS de filtros solares, aceites esenciales, extractos vegetales y formulaciones.15-18

El objetivo de este trabajo fue determinar in vitro el factor de protección solar del Gel Fotoprotector Epidérmico a través de la espectrofotometría ultravioleta, utilizando la ecuación de Mansur.

 

MÉTODOS

Preparación de las muestras: Se utilizó el Gel Fotoprotector Epidérmico Lote 13001 suministrado y liberado por la planta de producción del Centro, el cual cumplió con las especificaciones de calidad establecidas.19

Se elaboró un placebo a escala de laboratorio que contenía todos los ingredientes de la formulación a excepción del extracto de cordón umbilical (EC-30) el que se sustituyó por etanol fino clase A al 78 %. Todas las materias primas empleadas estaban liberadas como conformes y aptas para el uso.

Se realizaron diluciones de 1g del gel fotoprotector en 25 mL de etanol fino clase A al 96 %, se filtró con papel de filtro análisis cuantitativo (1240) de 125 mm de diámetro y se determinó el FPS por el método de Mansur. Las lecturas de Absorbancias se realizaron contra blanco del placebo para eliminar las posibles interferencias de las sustancias auxiliares.

Cálculo del FPS

Para la determinación espectrofotométrica se empleó el espectrofotómetro T80 UV/VIS Spectrometer. La Absorbancia de las soluciones se determinó a una longitud de onda (λ) de 290-320 nm, con intervalos de 5 nm, realizando tres determinaciones para cada λ. El cálculo del FPS se realizó mediante la ecuación propuesta por Mansur.

FPS= Factor de Protección Solar

FC= Factor de Corrección =10, determinado con dos filtros solares de FPS conocidos de tal forma que una muestra que contenga 8 % de Homossalato produjera un FPS=4.

EE=Efecto eritemogénico de radiación a una λ en nm.

II= Intensidad de la radiación solar a una λ en nm.

Abs= Lectura espectrofotométrica de Absorbancia de la solución a una λ en nm.

Los valores de EE (λ) x II (λ) ya habían sido calculados anteriormente por Sayre y colaboradores,20 (anexo 1) partiendo del principio que FPS es el inverso de tramitancia; teniendo en consideración la ponderación obtenida por la Normalización de la curva eritemogénica solar.

Teniendo en cuenta que es un método establecido y reconocido en la literatura científica se evaluó la precisión del cálculo del FPS según la Regulación 42007 del Centro Estatal para el Control de los Medicamentos (CECMED).21

Precisión : Se sugieren los modelos de repetibilidad, seis réplicas. Con ellas se determinaron los valores medios, la desviación estándar y el coeficiente de variación.

Precisión intermedia: Se utilizaron los modelos de seis réplicas y dos analistas en días diferentes.

Procedimiento para la recolección de los datos

Los datos se recolectaron en una base de datos y se analizaron por Microsoft Excel. La información almacenada en el espectrofotómetro se conservó en la carpeta del modo fotométrico del equipo.

Análisis estadístico

Precisión: Se calculó la media, coeficiente de variación y desviación estándar. Se tuvo como criterio de aceptación coeficiente de variación menor o igual que 3 % según lo establecido para la validación de métodos espectrofotométricos.21 Para la evaluación de la precisión intermedia durante la validación además de los coeficientes de variación se aplicaron las pruebas de Fisher y la t de Student con un nivel de confianza de 95 %, con el objetivo de determinar si existen diferencias significativas entre los resultados al variar las condiciones de análisis.

Criterio de aceptación

- Coeficiente de variación de cada analista por día ≤3 %.

- Coeficiente de variación general ≤3 %.

- Test de Fisher: Fexp<F tab para que no existan diferencias significativas entre los resultados obtenidos por los dos analistas.

- Test de Student: texp< ttab para que no existan diferencias significativas entre las medias obtenidas por los dos analistas.

 

RESULTADOS

El valor obtenido en la determinación del FPS del Gel Fotoprotector Epidérmico, aplicando la ecuación de Mansur fue de 11.10±0.02 según se observa en la tabla 1.

En los estudios de repetibilidad en la determinación del factor de protección solar del Gel Fotoprotector Epidérmico realizado a una misma muestra, por el mismo analista, el mismo día, a través de 6 réplicas, se alcanzó un coeficiente de variación intraensayo adecuado, lo que demuestra la buena precisión del método; se observa una variabilidad de los resultados dentro de los límites establecidos para los métodos espectrofotométricos: Coeficiente de variación (CV) ≤ 3,0 %.21 (Tabla 2).

En la tabla 3 se muestran los valores de FPS del Gel Fotoprotector Epidérmico obtenidos por dos analistas en días diferentes, la variabilidad obtenida cumple con los límites establecidos para este tipo de métodos.21

El resultado del estudio de precisión intermedia del método desarrollado (tabla 4) muestra valores de F y t calculadas menores que los valores tabulados; Ftab, 2,81 y t tab, 2,07 para cada uno de los niveles estudiados. Los valores calculados para la prueba de Fischer fueron por analistas 0,38 y 1,78, lo que evidencia que no hay diferencias significativas entre las precisiones alcanzadas por los analistas en diferentes días, mientras que en la prueba de t de Student la t calculada por analista fue de 1,26 y 0,49; por lo que no hay diferencias significativas entre las medias para un 95 % de confianza. Los valores de coeficientes de variación interensayo fueron adecuados.

 

DISCUSIÓN

El FPS determinado por espectrofotometría es un número que evalúa el filtro o la sustancia en estudio, de acuerdo con la altura, largo y localización de su curva de absorción dentro del espectro UV.13,20,22 La recomendaciones de la Comisión Europea 2006/647/EC23 tiene definida la clasificación de los fotoprotectores según su FPS: "Baja protección" [FPS 6-15], "Media protección" [SPF 15-30] y "Alta protección'" [SPF 30-60]. Los resultados obtenidos ubican al Gel Fotoprotector Epidérmico como un producto que posee una protección baja, con una limitada absorción en la región del UVB y no bloquea las radiaciones UVA, por lo que no se considera un protector de amplio espectro.

El sistema de numeración de los fotoprotectores no es lineal. Así, para factores bajos de protección, la actividad real del producto (porcentaje de reducción de la radiación eritemática activa) se incrementa considerablemente. Sin embargo, en valores altos, los aumentos del FPS representan incrementos mínimos de reducción (anexo 2), según refiere Montero Querol en su método de validación de fotoprotectores.7 Los resultados obtenidos en nuestro estudio indican que el Gel Fotoprotector Epidérmico es capaz de reducir entre el 90-95 % de la radiación activa que produce eritema, lo que demuestra la eficacia del producto.

En la determinación in vitro del factor de protección solar intervienen varios factores como son la concentración y solubilidad de la muestra, el diluente empleado para disolver el filtro o protector solar y la interacción entre los componentes del vehículo.16 Todos estos aspectos se tuvieron en cuenta para estandarizar el método y obtener resultados reproducibles.

La precisión del método, evaluada como repetibilidad y precisión intermedia, mostró resultados satisfactorios. Los valores obtenidos cumplen con lo establecido en cuanto a los coeficientes de variación para los métodos espectrofotométricos ≤3 %.

Esta metodología aunque es in vitro presenta una buena correlación con los métodos in vivo, pues relaciona la absorbancia del filtro o protector solar, con el efecto eritemogénico de radiación e intensidad de la luz a una longitud de onda de 290-320 nm, espectro específico del UVB.20

En 1999 Santos y colaboradores24 realizaron estudios comparativos entre los valores obtenidos por el Método de Mansur in vitro y por la metodología in vivo del FPS de fotoprotectores en forma de lociones que contenían filtros inorgánicos a diferentes concentraciones. Otras publicaciones posteriores especialmente de la industria cosmética brasileña reportan similar correlación entre el método de Mansur y los ensayos in vivo para el cálculo del FPS.25,26

El bronceado es la principal respuesta fotoprotectora fisiológica de nuestra piel. Se considera que el bronceado provee un factor de protección solar que oscila entre 2 y 4, además de reducir el fotodaño del ADN. De hecho, existe una relación inversa entre el contenido de melanina de nuestra epidermis y dichos fotoproductos del ADN. Parece que el daño en el ADN inducido por la radiación UV o su reparación son algunas de las señales iniciales que estimulan la melanogénesis. De esto se deduce que estimulando la producción de melanina en sí misma, sin haber una exposición solar previa, se reduciría el daño en el ADN cutáneo.27

La presencia de aminoácidos en el EC-30 como la tirosina (1.66 mg/100 mL) y fenilalanina (1.43 mg/100 mL) explica el efecto bronceador del Gel Fotoprotector Epidérmico por ser sustrato y precursor respectivamente, para la síntesis de melanina durante el proceso de melanogénesis; al incrementar las concentraciones de este aminoácido en el organismo y a su vez producir más melanina.28

El uso de extractos de cordones umbilicales en la elaboración de protectores solares no tiene antecedentes. Aunque el Gel Fotoprotector Epidérmico no tiene un pico máximo de absorción en la zona del UVB es importante señalar que en la absorción de los compuestos químicos de un protector solar no solo cuenta el pico de mayor absorción sino todas las longitudes de onda adyacentes.29

El aporte local de los aminoácidos ya mencionados además de cisteína, lisina, arginina, isoleucina, histidina, alanina y valina, 28 así como de ácidos nucleicos, proteínas y lípidos presentes en el EC-3032 convierten al Gel Fotoprotector Epidérmico un producto de elección para proteger la piel de pacientes con determinadas enfermedades como el caso del albinismo, el vitíligo, el xeroderma pigmentoso, las porfirias, por citar algunos ejemplos. El uso de este producto por más de 15 años sin reportarse reacciones adversas garantiza su inocuidad.

Es importante considerar el empleo de protectores solares como una estrategia eficaz para reducir el daño actínico, por lo que el acceso a este producto en la farmacia del Centro garantiza su uso regular en los pacientes, especialmente los fototipos I y II más sensibles a los efectos nocivos de los rayos solares.

La determinación del FPS por espectrofotometría ultravioleta utilizando la ecuación de Mansur es un método sencillo, económico y reproducible, que no involucra gran cantidad de reactivos ni se requiere un entrenamiento especial del operador del equipo, ya que es bastante fácil, por lo que puede ser aplicado en la industria cosmética y farmacéutica para conocer y mejorar las propiedades fotoprotectoras de extractos naturales, formulaciones en fase de desarrollo; así como, en productos intermedios y terminados.

A partir del cálculo del FPS del Gel Fotoprotector Epidérmico o Protector Solar se trazaron estrategias de trabajo para el desarrollo de nuevas generaciones que garanticen un mayor espectro de absorción de las radiaciones solares y de esta manera acercarse aún más al concepto ideal de fotoprotector.

 

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Recibido: Febrero de 2014.

Aprobado: Junio de 2014.

 

 

Correspondencia: MSc. Maydelin Trujillo Alfonso, Centro de Histoterápia Placentaria, La Habana. Correo electrónico: fdc@infomed.sld.cu