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Revista Cubana de Hematología, Inmunología y Hemoterapia, enero-junio, 1995

Técnicas

Instituto de Hematología e Inmunología Ciudad de La Habana, Cuba

Introducción de un ultramicrométodo inmunocitoquímico para la cuantificación de subpoblaciones linfocitarias identificadas con anticuerpos monoclonales

Lic. René A. Rivero Jiménez, Dra. María Bello Rodríguez, Lic. Lilia E. Suárez Batista, Lic. Carlos Cruz Sotolongo, Lic. Marta Martínez Solís y Téc. Lourdes Palma Salgado

RESUMEN

Se introdujo en nuestro laboratorio un ultramicrométodo inmunocitoquímico (UMICIQ) para la cuantificación de las principales subpoblaciones de linfocitos T identificadas con los anticuerpos monoclonales anti-CD2, anti-CD3, anti-CD4 y anti-CD8. Las determinaciones se realizaron en células mononucleares de sangre periférica de donantes de sangre supuestamente sanos, con edades entre 21 y 47 años. El estudio de los 15 primeros individuos se realizó tanto por el UMICIQ como por un micrométodo de inmunofluorescencia indirecta (IFI), y cuando se compararon los resultados, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas. Para establecer los valores de referencia para el UMICIQ, se tomaron las muestras de 30 donantes. Con la aplicación de este método se pueden evaluar las subpoblaciones linfocitarias con una sensibilidad y especificidad similares a las observadas con la microtécnica de IFI; sin embargo, se introducen una serie de ventajas como: uso de menores concentraciones de células y por ende menor volumen de sangre para cada determinación, uso de diluciones mayores de los anticuerpos y conjugados, se hace innecesario el uso del microscopio de luz UV y de la centrífuga refrigerada, se pueden distinguir la morfología y el linaje de las células simultáneamente con la reactividad inmunológica de sus antígenos.

Palabras clave: HISTOCITOQUIMICA/métodos; SUBGRUPOS DE LINFOCITOS/citología; INMUNOFENOTIPIFICACION. INTRODUCCION

Los linfocitos humanos en sangre periférica, médula ósea, ganglios linfáticos y otros órganos linfoides, se pueden clasificar en dependencia de determina dos marcadores presentes en su superficie celular. En la actualidad existen numerosos anticuerpos monoclonales (AcMo) que reconocen a antígenos de diferenciación celular clasificados en conjuntos de diferenciación (CD);1 después del descubrimiento de estos CD, se han reconocido 2 importantes subpoblaciones de linfocitos T maduros humanos en sangre periférica, una que posee los antígenos CD2, CD3, CD4, CD5 y CD7, que representa entre el 55 y el 65 % de las células T y que reconoce a los antígenos en asociación con antígenos clase II del sistema principal de histocompatibilidad humano (HLA), con función auxiliadora/inductora de la supresión, y otra subpoblación que posee los antígenos CD2, CD3, CD5, CD7 y CD8, que representa entre el 20 y el 30 % de las células T, reconoce a los antígenos en asociación con antígenos clase I del sistema HLA y poseen una función citotóxica/supresora.2 Un defecto en la inmunorregulación debido a una disminución o incremento cuantitativo o cualitativo de estas subpoblaciones, puede tener repercusiones graves para la salud humana,3 además de que las glicoproteínas CD4 y CD8 desempe ñan por sí mismas una función importante en la activación de las células T y en la estabilización de sus interacciones con el complejo CD3-receptor para el antígeno de la célula T durante la presentación del antígeno.4

Existen numerosos métodos para la identificación y la cuantificación de las células que participan en la respuesta inmunológica, entre ellos, los métodos de inmunofluorescencia (directa = IFD e indirecta = IFI) que se usan en muchas áreas de las investigaciones biomédicas por su alta sensibilidad y especificidad,5 aunque con frecuencia se presentan problemas de índole práctico provocados por coloraciones no específicas y por tinciones específicas no deseadas, que se pueden resolver seleccionando cuidadosamente los anticuerpos primarios y los antisueros conjugados. Los métodos de inmunofluorescencia (IF) requieren de un gran número de células y la preparación y examen individual de cada muestra, y si no se dispone de un citómetro de flujo, es un método con una evaluación al microscopio lenta y engorrosa, lo que impide su utilización para el estudio masivo de pacientes. Por otra parte, la citometría de flujo, que es una tecnología con grandes perspectivas, totalmente automatizada y asistida por computado ras, se basa en hacer pasar un flujo monocelular de elementos particulados a través de una pantalla de rayos láser, las células se caracterizan primero por su tamaño y se separan las mezclas según su tipo celular, gracias a la reacción de los anticuerpos directamente conjugados con fluorocromos que emiten luz fluorescente en determinada longitud de onda, lo que permite realizar estudios de doble y triple marcado res simultáneamente en una misma muestra celular.5 Sin embargo, el elevado costo de estos equipos y de los reactivos necesarios para su aplicación, no contribuyen a que esta tecnología esté al alcance de todos. Como una alternativa a las técnicas de IF, se han desarrollado técnicas de inmunoperoxidasa6,7 que en lugar de un conjugado fluorescente, emplean antisueros conjugados con esa enzima; en estos casos, la reacción inmunológica antígeno-anticuerpo se visualiza gracias a la reacción de la peroxidasa con su substrato (H2O2) en presencia de un agente cromógeno, lo que da lugar a un producto coloreado insoluble que se deposita en el lugar donde ocurrió la reacción inmunológica.

En este trabajo se describe la introducción de un ultramicrométodo inmunocitoquímico (UMICIQ), basado en una reacción de inmunoperoxidasa, para la cuantificación de las principales subpoblaciones linfoides en sangre periférica, que presenta una sensibilidad y especificidad al menos similares a la de la microtécnica de IFI previamente normalizada en nuestro laboratorio,8 y se establecen los valores normales con muestras de donantes de sangre adultos, con vistas a su aplicación inmediata al diagnóstico de estados de inmunodeficiencia y al inmunofenotipaje de células para el diagnóstico inmunológico de leucemias y linfomas.

MATERIAL Y METODO

MUESTRAS Y REACTIVOS

Se tomaron muestras de sangre periférica de 30 individuos supuestamente sanos, donantes voluntarios de sangre que acudieron al Servicio de Transfusiones del Instituto de Hematología e Inmunología, y que cumplieron los siguientes criterios de inclusión: adultos menores de 50 años, que no habían recibido ningún tipo de hemoterapia al menos en los 3 meses previos al estudio, sin síntomas de infección, ni tratamiento con inmunomoduladores, no expuestos a regímenes de ejercicios físicos, radiaciones solares intensas o ingestión abusiva de bebidas alcohólicas en los 30 días previos al estudio. A todas las muestras se les realizó un leucograma completo por el método establecido en nuestro instituto, y las subpoblaciones de linfocitos T se identificaron con los AcMo siguientes: ior-T11 (anti-CD2), ior-T3 (anti-CD3), ior-T4 (anti-CD4) e ior-T8 (anti-CD8) (CIMAB SA, La Habana, Cuba) y con antisueros conjugados con peroxidasa de rábano: anti- IgG de ratón obtenido en cabra, purifi cado por afinidad, y anti-IgG de ratón obtenido en conejo, purificado por afinidad (IHI, La Habana, Cuba), para el UMICIQ, y un antisuero anti-IgG de ratón conjugado con fluoresceína (BIOCEN, La Habana, Cuba) para la IFI.

Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica

Las muestras de sangre hepariniza da diluida 1:2 con una solución balanceada de fosfatos, 0,1 M, pH 7,4 (SBF- -1), se depositaron sobre un volumen igual de Ficoll-Paque o Ficoll-Telebrix (d 1,077 g/cm3) en tubos de centrífuga de 12 mL de volumen final, para realizar el aislamiento de células mononu cleares de sangre periférica (CMSP) según una modificación del método de Boyüm;9 se centrifugaron a 1,200 x g durante 20 minutos a 20 oC, se extrajo con una pipeta Pasteur el anillo que contiene CMSP en la interfase, y se diluyó en SBF-1. Las células se lavaron 2 veces mediante centrifugación a 200 x g durante 15 minutos, se resuspendieron en medio, (cuando fue necesario, se eliminaron los hematíes contaminantes con un choque osmótico usando 1 mL de H2O bidestilada estéril a 4 oC, durante 1 minuto). La concentración se ajustó según el método de inmunofeno tipaje a emplear: 2 x 106 cel/mL para el UMI-CIQ y 10 x 106 cel/mL para la IFI, y se determinó la viabilidad. Sólo se utilizaron preparaciones con más del 95 % de células viables, según el método de exclusión con tripán azúl.

Micrométodo de IFI

Se utilizó el micrométodo de IFI normalizado en nuestro laboratorio:8 las CMSP se resuspendieron en medio MEM-Eagle suplementado con 2 % de suero humano AB inactivado; 50 mL de la supensión celular se añadieron a microplacas de 96 pozos de fondo en U y se incubaron durante 30 minutos con 10 mL de cada AcMo a 4 oC, se lavaron con SBF-1 con 2 % de suero humano AB y 0,1 % de azida sódica 3 veces con centrifugación a 300 xg durante 5 minutos a 4 oC, y como segundo anticuerpo se utilizaron 10 mL de un antisuero de carnero anti-IgG de ratón conjugado con isotiocinato de fluoresceína en su dilución óptima. Se hizo una incubación de 30 minutos a 4 oC, un lavado en iguales condiciones y final mente, las células marcadas se resuspendieron en solución de montaje compuesta por 30 % de SBF, pH 8,6 y 70 % de glucerina, se colocaron en láminas portaobjeto, se cubrieron con cubreobjeto 22 x 22 mm y se sellaron con barniz de uñas. La lectura al microscopio se realizó en un Dialux 20 EB con epiiluminación de lámparas UV/luz vivible (Wild Leitz, RFA), y se contaron al menos 200 células por cada determinación.

UMICIQ

Este método se basa en el desarro llado por Krans y Thierfelder para la detección de TdT intracelular10 con una modificación de Cruz et al. (Detección mejorada del antígeno CD2 por un ultramicrométodo inmunocitoquímico en células T no-deshidratadas unidas a láminas recubiertas con poli-L-lisina y fijadas con vapores de formaldehído). Emplea células no-deshidratadas con carga eléctrica negativa, unidas electros tásticamente a sitios de reacción (SR) cargados positivamente por la presencia de poli-L-lisina (PLL)11 los antígenos se fijan con vapores de formaldehído al 37 % (FA), y se emplea un sistema de revelado con doble capa de antisueros conjugados con peroxidasa (doble sandwich) y el 3-amino-9-etil-carbazol (AEC) como cromógeno, en láminas que poseen 21 SR.

PREPARACION DE LAS LAMINAS

PORTAOBJETO

Se colocaron las láminas portaobjeto de 76 x 26 mm, prelavadas, listas para usar, en una solución de etanol-éter (volumen a volumen), para eliminar cualquier residuo de grasa, sin tocar las láminas con los dedos para evitar que se contaminen con la grasa natural, y se secaron con gasa limpia. Se colocó una solución de goma arábiga (0,2 g de goma arábiga y 0,2 g de sacarosa/mL) en una placa de Petri, de manera que el fluido quedó aproximadamente a 1 cm de altura, se introdujeron las puntas de los 21 capilares que componen el dispensador de goma arábiga en este fluido y se ensayó con láminas desechables hasta que al poner en contacto las puntas de los capilares con las láminas portaobjeto se obtuvieron puntos de goma de aproximadamente 10 mL de volumen. A partir de este momento, con este dispensador se dejaron caer 21 gotas de la suspensión de goma arábiga sobre cada lámina y se esperó a que se secaran, guardándolas durante la noche en un estuche portalámina a temperatura ambiente. Al otro día se cubrieron con una solución de dimetil- polyxiloxano (DMPS-2X) (15,5 % de DMPS-2X, 83 % de propanol, 1,5 % de ácido sulfúrico concentrado), para lo que se utilizó un aplicador de madera con algodón, en forma de hisopo. Las láminas se guardaron durante la noche, en iguales condiciones que el día anterior. Al siguiente día se pulieron con un hisopo de algodón seco para eliminar el exceso de DPMS-2X. Inmediatamente después se eliminó la goma arábiga de las 21 posiciones, para lo cual, se colocaron 10 mL de una solución de Extran al 5 % encima de cada gota de goma arábiga, se esperó 15 minutos, se eliminó el Extran con el uso de una aspiradora y se colocaron 10 mL de esta solución una vez más sobre cada posición marcada por la goma arábiga, se esperaron 15 minutos nuevamente y finalmente, si no quedaba ningún resto de goma arábiga, se colocaron en un contenedor portalá mina para sumergirlas en un recipiente de 2 litros de capacidad (beaker) que contenía aproximadamente 1 L de H2O bidestilada. Después de colocarlo sobre un agitador magnético, el agua se agitó durante 2 ó 3 horas, cambiándola cada media hora para garantizar un lavado óptimo; concluido el proceso de lavado, las láminas se secaron por la parte trasera, que no contiene DMPS-2X, con papel absorbente o un paño limpio. Después se colocaron sobre una meseta de trabajo y una vez retirada con la aspiradora el agua remanente sobre su superficie no hidrófoba (las 21 posiciones que quedaron marcadas), se coloca ron 10 mL de H2O destilada sobre cada sitio de reacción (SR). Las láminas se conservaron en una cámara húmeda en el refrigerador hasta el día siguiente o por 2 días, si era necesario. Después de este proceso, se eliminó con la aspiradora el agua sobre cada SR y se colocaron, en su lugar, 10 mL de una solución de poli-L-lisina (PLL) (0,1 % de PLL de peso molecular 70,000-150,000 en SBF-1), se incubó una noche en el refrigerador y las láminas que no se usaron al día siguiente, se conservaron en un congelador a -20 oC, dentro de una cámara húmeda hasta el momento de su uso. La PLL remanente se eliminó sólo inmediatamente antes de colocar la suspensión celular.

UNION DE LAS CELULAS A LAS LAMINAS Y FIJACION DE SUS ANTIGENOS

Las CMSP se lavaron 3 veces con SBF-1 libre de sueros y se resuspendie ron en medio MEM-Eagle con sales de Earle (MEM) libre de suero, una vez ajustada la concentración celular. En cada SR, con el uso de un frasco lavador con SBF-1, se eliminó previamente la PLL remanente, y se colocaron 10 mL de la suspensión celular, se incubaron a 4 oC, durante 30 minutos, y luego 5 minutos a temperatura ambiente. Para lavarlas, las láminas se introdujeron por 10 a 15 segundos en un recipiente con SBF-1, y posteriormente se introdujeron en un recipiente de tinción que contenía gasa embebida en FA, para que sus vapores estuvieran en contacto con las células durante 10 minutos como máximo a temperatura ambiente. Una vez concluida esta fijación, las láminas se lavaron introduciéndolas sucesiva mente en 3 recipientes que contenían SBF-1, en los 2 primeros durante 10 segundos, y en el último durante 15 minutos. Para bloquear las posibles reacciones inespecíficas, se utilizaron 20 mL de una mezcla de medio MEM suplementado con 0,2 % de albúmina sérica bovina y 0,2 % de gelatina, balanceado con HEPES 1 M, pH 8,1 (MAG), por cada SR, y se incubaron con este agente bloqueador durante 30 minutos como mínimo en el refrigerador, o alternativamente, se dejaron durante la noche a esta misma temperatura, siempre en cámara húmeda. Después de este paso, las láminas se lavaron con 10 mL de SBF-1 sobre cada SR, al menos 3 veces, evitando que se deshidrataran las preparaciones.

DESARROLLO Y REVELADO DE LA REACCION ANTIGENO-ANTICUERPO

Se colocaron 10 mL de los anticuerpos monoclonales en su dilución óptima previamente determinada por nosotros, sobre cada SR (Suárez L, et al . Ultramicrométodo inmunocitoquímico: titulación de los anticuerpos primarios y antisueros conjugados). Se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente, se lavaron los SR quitando con vacío el líquido remanente y agregando simultáneamente 10 mL de SBF-1. Posteriormente, se introdujo cada lámina 3 veces en cada beaker con SBF-1, para garantizar un lavado óptimo. Después, las láminas se coloca ron nuevamente en vapores de FA, pero sólo por 5 minutos, se lavaron otra vez con SBF-1 con el mismo procedimiento utilizado después de la primera fijación con FA, y a continuación se añadieron 10 mL de una mezcla de 4-cloro-1-naftol (1 mg/mL) con H2O2 al 0,015 % (4C1N) cada SR (por 2 veces), protegiéndose de la luz, y se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente, para revelar la presencia de células con actividad endógena de la enzima peroxidasa. Una vez concluido este paso, se repitieron los lavados con SBF-1, y se añadieron 10 mL de sulfato de cobre (0,02 M) (por 2 veces) sobre cada SR, se incubó por 10 minutos, y se repitió la colocación e incubación con los mismos anticuerpos usados al inicio. Una vez concluidos los lavados con SBF-1, se colocaron 10 mL del antisuero de cabra anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa; las láminas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente, protegidas de la luz, se lavaron 3 veces con SBF-1 siguiendo el mismo procedimiento anterior, y se colocaron 10 mL de un segundo antisuero conjugado con peroxidasa, esta vez, un antisuero anti-IgG de cabra obtenido en conejo, usando un procedimiento idéntico al utilizado con el primer conjugado. Una vez concluido el proceso de lavado con SBF-1, se preparó en el interior de una campana extractora de gases tóxicos e inmediatamente antes de su uso, la mezcla de AEC con H2O2, para lo cual se colocaron en una probeta graduada de 50 mL, 4,7 mL de una solución balanceada de fosfatos (0,5 M, pH 6,9) (SBF-2) concentrada 10 X, se completó con agua bidestilada hasta 47 mL, y se añadieron a un recipiente de tinción que contenía 2 mL de la solución stock de AEC (1,67 g de AEC por litro de dimetil-sulfóxido). Después, se añadieron 7,5 mL de H2O2 al 30 %, con agitación suave para promover la mezcla, y en dicho recipiente de tinción se introdujeron las láminas durante 25 minutos a temperatura ambiente y protegidas de la luz; luego se extrajeron con el uso de pinzas, se colocaron dentro de un beaker con SBF-1 por unos segundos y seguidamente en otro con el mismo contenido durante 15 minutos. Fuera de la campana extractora, se pasaron a otro beaker con agua bidesti lada y se incubaron durante otros 15 minutos, para facilitar la contra- coloración con hematoxilina de Harris. Esta contracoloración se realizó inmediatamente después o al día siguiente, colocando las láminas en un recipiente de tinción que contenía 50 mL de hemalón (1 g de hematoxilina de Harris, 0,2 g de yoduro de sodio, 50 g de sulfato de aluminio-potasio dodecahi dratado, 50 g de hidrato de cloral, y 1 g de ácido cítrico/L), durante sólo 55 segundos; luego se lavaron con agua corriente durante 15 segundos, y finalmente se introdujeron en un vaso de tinción con agua corriente durante 15 minutos. Para poder observar las preparaciones al microscopio óptico, cada SR se recubrió con 10 mL de una solución de montaje ( 64 % de glicerina, 4 % de glutaraldehído al 25 %, en SBF-1) se colocó un cubreobjeto de 56 x22 mm, evitando la acumulación de burbujas de aire entre ambas superficies de vidrio y las láminas se sellaron finalmente con barniz de uñas.

Con este UMICIQ también se pueden realizar estudios para detectar antígenos intracelulares, para lo cual, una vez que en los RS en que se harán los procedimientos previamente detalla dos, como la primera incubación con los anticuerpos primarios, los lavados con SBF-1, la segunda fijación con vapores de FA y la detección de la actividad endógena de peroxidasa con 4C1N, entonces los SR preseleccionados para el estudio de los antígenos intracelulares donde estas reacciones no se ejecutan, se tratan con 10 mL de una solución de BRIJ-56 al 0,004 % en SBF-1, por 2 veces, se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente, se lavan con SBF-1 como en los pasos anteriores, y se colocan 10 mL del anticuerpo prima rio, para que penetre a través de la membrana permeabilizada, y luego el resto del procedimiento continúa como ya se explicó.

Antes de la lectura en el microscopio óptico, las láminas selladas se pueden guardar a 4 oC por tiempo indefinido, y la lectura se realizó contando como mínimo 200 células en cada SR, con un lente objetivo de inmersión en aceite 100X, en un microscopio óptico de elevada resolución DIALUX 20 EB. La morfología se distinguió por el color azul que provoca el hemalón en el núcleo celular, las células con actividad endógena de peroxidasa (mieloides) se identificaron por la formación de un precipitado color azul prusia negruzco en su interior y se consideraron positivas aquellas células que reaccionaron con los anticuerpos y en presencia del AEC formaron un precipitado color pardorrojizo en el lugar de la reacción: borde de las células si el antígeno está en la superficie, y en el interior de las células si se trata de un antígeno intracitoplasmático, mientras que las células negativas no presentaron este precipitado.

Procesamiento estadístico

Con las cifras absolutas (x109/ /células/L) de leucocitos y el porcentaje de linfocitos y monocitos, se calculó el valor absoluto de CMSP en cada muestra. Una vez conocidos los resulta dos del inmunofenotipaje por ambos métodos, se calculó el valor relativo (%) y el valor absoluto (x109/L) de las células que reaccionan con cada AcMo, por cada método. Se comprobó la normalidad estadística de estos resulta dos con la prueba de Komolgorov- Smirnov, y se calculó la media aritmética (?) y la desviación estándar (DE) para cada serie de datos. Con los resultados de los primeros 15 individuos, estudiados en paralelo por ambos métodos de inmunofenotipaje, se aplicó la prueba de la t pareada para comparar cada variable dependiente y una prueba de correlación. Se consideraron como rango normal del UMICIQ, los valores comprendidos entre ? +/- DE, en el total de donantes. Las diferencias se consideraron significativas para una p < 0,05.

RESULTADOS

Se estudiaron muestras de sangre periférica de 30 donantes (20 hombres y 10 mujeres) que cumplieron con los requisitos de inclusión, y las características del grupo se muestran en la tabla 1. Cuando se determinaron los valores relativos y absolutos de las subpoblaciones CD2+, CD3+, CD4+, CD8+ y las unidades del índice CD4/CD8 en los 15 primeros donantes, evaluados simultáneamente por los métodos de IFI y UMICIQ, se arribó a los resultados que se detallan en la tabla2. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre ninguna de las variables dependientes comparadas entre sí. Con los datos obtenidos con la totalidad de los donantes se calculó el rango normal de cada una de las subpoblaciones linfocitarias T detectadas con el IMICIQ (tabla 3), y se comprobó que éstos tampoco difieren estadísticamente de los valores de referencia establecidos previamente en nuestro laboratorio para la IFI.

DISCUSION

Las preparaciones celulares y secciones histológicas se pueden tipificar con fines diagnósticos, tanto por métodos de IF como de inmunocitoquí mica (ICQ), con la participación de enzimas, fundamentalmente fosfatasa alcalina12 y peroxidasa,13 y con el empleo de anticuerpos (policlonales o monoclonales) que reconocen a los antígenos en la superficie o el interior de las células. Estos métodos se aplican con éxito al estudio de las inmunodeficiencias y a la caracterización inmunológica de las células malignas en pacientes con leucemias, linfomas y otras enfermedades hematológicas y oncológicas. Los métodos de ICQ presentan algunas ventajas sobre los de IF, como la posibilidad de visualizar las células a través del microscopio óptico, observan do simultáneamente la morfología celular y la reacción inmunológica de sus antígenos con los anticuerpos específi cos, la posibilidad de estudiar antígenos intracelulares e intranucleares, mediante el uso de detergentes no-iónicos como el BRIJ 56 o el NONIDET-p40, que facilitan la penetración de los anticuerpos sin causar daños a la estructura del antígeno,14 y la posibilidad de conservar las preparaciones coloreadas por largos períodos sin que se pierdan las caracte rísticas que identifican a las células marcadas. La introducción del UMICIQ aporta además las ventajas de realizar hasta 21 determinaciones en una misma lámina portaobjeto, utilizar bajas con centraciones celulares (2 x 106 cel/mL) que hacen factible el estudio de muestras con poca celularidad o a partir de menores volúmenes de sangre, y el empleo de anticuerpos con diluciones más altas que las que se emplean para la IFI, lo que contribuye al ahorro de este recurso altamente costoso y amplía las posibilidades de su utilización a un mayor número de pacientes.

En el presente estudio, se analiza ron muestras de células normales procedentes de 15 donantes, por ambos sistemas de detección, y los resultados obtenidos resultaron muy similares, con un índice de correlación satisfactorio y sin diferencias estadísticamente significativas entre los resultados de un método y el otro, por lo que se obtuvo un nivel de sensibilidad y especificidad similares, y se establecieron los valores de referencia para estas determinaciones en nuestro laboratorio, tomando en cuenta que los donantes seleccionados presentaban un estado de salud adecua do y no estaban sometidos a procesos que de manera indirecta podrían afectar la cantidad de células de cada subpoblación. Este resultado confirma la utilidad del UMICIQ para la determinación del fenotipo celular y su aplicación al diagnóstico de enfermedades inmunológicas, entre ellas el diagnóstico ampliado del SIDA,3 y hematológicas. La posibilidad de estudiar estas células sin coloraciones inespecíficas (background), está dada por el uso de las diluciones apropiadas, tanto de los anticuerpos primarios como de los conjugados. La posibilidad de discriminar entre las células linfoides y mieloides, por la actividad de la peroxidasa endógena y su reacción con el 4C1N-H2O2, facilita la lectura e interpretación de los resultados si se compara con la IFI, donde no es posible distinguir su morfología ni el linaje de las células que se evalúan.

Muchos trabajos en la literatura informan sobre los métodos para amplificar las señales primarias que aportan los anticuerpos en su reacción con el antígeno, tanto en la IFI como en la ICQ, pero pocos ponen el énfasis en la definición de las condiciones que preserven de forma óptima al antígeno. Tanto los métodos de peroxidasa-anti-peroxidasa (PAP)15 como los de avidina-biotina-peroxidasa,16 permiten disminuir de 2 a 8 veces la concentración de los anticuerpos primarios, cuando se comparan con la IF,17,18 lo que está en concordancia con el ahorro de anticuerpos primarios y de conjugados que se logra con el UMICIQ, donde se emplea una técnica de doble conjugado (doble sandwich) como sistema de amplificación, y los antígenos se preservan por la acción del FA, que es un monoaldehído. Cuando se analizó la posibilidad de utilizar otros sistemas amplificadores, se tuvo en cuenta que aunque ellos incrementan la sensibilidad en la detección de los anticuerpos primarios unidos específicamente a las células, también lo hacen con respecto a los anticuerpos unidos inespecíficamente que dan lugar al background, por lo que no se logra un incremento de la sensibilidad en términos de incrementar la relación "señal/ruido". Con el UMICIQ, como se usan células no-deshidratadas unidas electrostáticamente al vidrio, la detección de antígenos mejora, porque se eliminan los posibles artefactos que provocarían la desnaturalización y difusión de los antígenos si las células se hubieran secado al aire y fijado con agentes orgánicos como el metanol.19

Este sistema normalizado hace cada determinación más económica, evita la pérdida de epitopes antigénicos por desnaturalización o difusión, y aunque estos resultados se obtienen a expensas de un procedimiento bastante largo y laborioso, éste se acorta por la posibilidad de preparar las láminas tratadas con PLL de antemano y de guardarlas por tiempo indefinido almacenadas en grandes cantidades. El tiempo que se invierte en los lavados con SBF-1, es preferible por el menor gasto material y energético si se compara con el procedimiento de centrifugación con refrigera ción que se realiza en la IFI. Además, por razones prácticas, para la cuantificación de las subpoblaciones linfocitarias T, los tiempos de incubación con los anticuerpos primarios se podrían reducir y se podría emplear un sistema de un solo conjugado (sandwich simple), sin que se pierdan las ventajas mencionadas que permiten la detección más precisa de estos antígenos.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen y desean hacer constar que este trabajo fue posible gracias a una beca otorgada por la DAAD de la RFA y por el apoyo material del Prof. Dr. S. Thierfelder, Director del GSF Institut für Immunologie, Munich, Alemania.
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