Indice Anterior Siguiente
Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 1997;12(1)
Instituto de Hematología e Inmunología  Ciudad de La Habana, Cuba

Ultramicrométodo inmunocitoquímico (UMICIQ): su aplicación para cuantificar linfocitos T CD4+ en portadores del VIH y en pacientes con sida

Lic. Carlos Cruz Sotolongo Lic. Liliana Pérez Toledo Lic. René A. Rivero Jiménez1 Téc. Carmen M. González Martínez2 y Dr. Jorge Pérez Avila2

RESUMEN

Se aplicó el ultramicrométodo inmunocitoquímico (UMICIQ) para la cuantificación de linfocitos T CD4+ en portadores del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-I) y en pacientes con SIDA. Se estudiaron 260 portadores del VIH del Sanatorio de Santiago de Las Vegas y del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" y 26 controles normales. De los 260 infectados, 35 eran del grupo II, 33 del grupo III, 61 del IV y 31 se clasificaron como casos SIDA (IV-C1) (clasificación del CDC, 1986). Las comparaciones entre los grupos se realizaron mediante la prueba de la t de Student. Al comparar las medias de los valores de linfocitos T CD4+ del grupo de SIDA con el resto de los grupos se encontraron diferencias estadísticas tanto en valores relativos (%) como en valores absolutos (cel/m L). Sólo 6 de los 31 casos SIDA mostraron valores de linfocitos T CD4+ superiores a 200 cel/µ . Este método de cuantificación permite de forma económica, sensible y específica, detectar portadores de VIH con valores de linfocitos T CD4+ menores de 200 cel/m L y de esta forma clasificarlos según la definición ampliada de caso SIDA del CDC, 1993.

Palabras clave: INMUNOHISTOQUIMICA/métodos; LINFOCITOS T CD4-POSITIVOS; SINDROME DE INMUNODEFICIENCIA ADQUIRIDA; INFECCIONES POR HIV.

INTRODUCCION

En un gran número de portadores del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y en pacientes con SIDA, se ha comprobado que la cuantificación de los linfocitos CD4 (células diana del VIH) tiene valor tanto pronóstico como terapéutico; también se ha comprobado un riesgo aumentado de progresión a SIDA entre los portadores de VIH con valores relativos de linfocitos CD4 < 14 % y valores absolutos < 200 células/m L. Esto motivó que en 1992 el Centro para el Control de Enfermedades de los EE.UU. (CDC) estableciera una nueva clasificación de esta entidad, vigente a partir de 1993, en la que, a diferencia de la establecida en 1986, no sólo se contemplan los aspectos clínicos, sino que combina dichos aspectos con la cuantificación de los linfocitos CD4+, tanto en valores relativos como absolutos.1 Añade 3 condiciones clínicas: la tuberculosis pulmonar, la neumonía recurrente y el cáncer cervical invasivo, y además, mantiene las 23 condiciones clínicas para la definición de caso SIDA en el sistema de vigilancia del CDC-19872 (tabla 1).

TABLA 1. Sistema de clasificación revisado para la infección por VIH. Definición ampliada de caso SIDA para adolescentes y adultos, 1993

 
Categorías clínicas
 
(A)
(B)
(C)
Categorías de células T CD4+
Asintomático, infección aguda (primario) VIH o LPG
Sintomático, no clasificable como (A) o (C)
Condiciones indicativas de SIDA
(1) ³ 500 / m L
A1
B1
C1**
(2) 200 - 499/ m L
A2
B2
C2**
(3) < 200/m L*
A3**
B3**
C3**
LPG: linfoadenopatía persistente generalizada.

* Conteo de célula T indicador de SIDA.

** Definición ampliada de caso SIDA para vigilancia: las personas con condiciones clínicas indicativas de SIDA (categoría C) así como aquellas con conteos de linfocitos T CD4 < 200/ m L (categoría A3 B3).

En la actualidad, todo trabajo relacionado con el control evolutivo de los infectados, ensayos clínicos de nuevas drogas y otros, en esta entidad, conlleva obligatoriamente la cuantificación de esta subpoblación linfocitaria fundamentalmente para mantener la homeostasis de los mecanismos que rigen la inmunidad mediada por células.3-8

En este trabajo se describe la aplicación del ultramicrométodo inmunocitoquímico (UMICIQ) como un método altamente sensible y económico con estos fines.

MATERIAL Y METODO

Se cuantificaron los linfocitos CD4+ en valores relativos (%) y absolutos (cel/m L) en 260 portadores de VIH del Sanatorio de Santiago de Las Vegas (SSV) y del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK), ambos de Ciudad de La Habana, 196 del sexo masculino y 64 del sexo femenino. También se cuantificaron dichas células en un grupo de 26 sujetos supuestamente sanos, comprendidos en el mismo rango de edad que el grupo de estudio. Los 260 portadores de VIH se subdividieron inicialmente según la clasificación propuesta por el CDC/OMS 1986,9 correspondiendo 135 al grupo II, 33 al gupo III, y 92 al grupo IV. Este último grupo estuvo constituido por 6 pacientes del subgrupo IV-A, 31 del IV-C1 (SIDA), 51 del IV-C2, 2 del grupo IV-D y 2 del IV-E. Para la cuantificación de los linfocitos CD4+ se empleó un método inmunocitoquímico10-11 modificado por nosotros (UMICIQ),12,13 que utiliza láminas portaobjeto previamente preparadas en el laboratorio y que presenta básicamente 21 sitios de reacción (SR) de aproximadamente 3 mm2 cada uno, tratados con poli-L-lisina. En las zonas inter-SR se aplicó previamente dimetil-polixilosano al 15 % (sustancia repelente al agua), lo que evita la mezcla de células y reactivos entre los SR.

En cada SR se depositaron 10 m L de la suspensión de las células mononucleares objeto de estudio a la concentración de 3-4 x 106/mL, las cuales se obtuvieron a partir de 3 mL de sangre venosa heparinizada mediante gradiente de densidad con Ficoll-Telebrix 38, densidad = 1,077 g/mL, según una modificación del método de Böyum.13

Luego las células se fijaron con vapores de formalina (formol al 37 %) durante 15 min a 20 ° C, según se informó previamente13. Posteriormente se añaden 10 m L del anticuerpo monoclonal anti-CD4 ior-t4 (CIMAB SA, La Habana) a la dilución de trabajo previamente establecida (1:100)14 y a continuación se realizó la coloración enzimática con 4-cloronaftol-H2O2 como cromógeno-sustrato con el fin de detectar las células (células mieloides) con actividad endógena de peroxidasa (coloración azul prusia); seguidamente se utilizó CuSO4 para detener la reacción de la peroxidasa endógena, y por último, se aplicaron seguidamente, incubando en cada caso 45 min a 20° C, 2 anticuerpos policlonales conjugados con peroxidasa: el primero anti-IgG de ratón producido en cabra (IHI, La Habana), y el segundo, anti-IgG de cabra producido en conejo (IHI, La Habana). La reacción enzimática final se detectó utilizando como cromógeno-sustrato al 3-amino-9-etil carbazol-H2O2 (coloración naranja rojiza) (células marcadas) y a continuación se realizó una coloración de contraste con solución de hemalón (células no marcadas). Las láminas se montaron con solución de glicerol al 80 % y de esta forma quedaron listas para su observación al microscopio óptico con lente de inmersión en aceite 100x. Se contaron al menos 200 células por SR para diferenciar las marcadas de las no marcadas. Las comparaciones entre grupos se realizaron mediante la prueba t de Student. Para establecer una correlación entre el estado clínico y la cantidad de células CD4+/m L según el UMICIQ, también se calcularon la especificidad, la sensibilidad y los valores predictivos positivos (VPP) y negativos (VPN) de este método, para lo que se utilizó el programa estadístico CALESTA (ver 1.0 sep. 1992) y se tomó como criterio de caso SIDA el definido según la clasificación del CDC de 1986. Es decir, que para calcular estos parámetros se consideró como positivo "verdadero" (PV) aquel paciente clasificado como IV-C1 cuyo valor de células CD4+ fue < 200/m L; como positivo "falso" (PF), aquél no clasificado como IV-C1 con valor de células CD4+ < 200/m L; como negativo "falso" (NF), a los casos IV-C1 con CD4+ < 200/m L; y como negativo "verdadero" (NV), a los casos no clasificados como IV-C1 y con células CD4+ > 200/m L, aunque se debe tener en cuenta que según la nueva definición, un positivo "falso" pasaría a ser positivo "verdadero" y los negativos "falsos" tampoco existirían, sino que serían "positivos" (IV-C1).9

RESULTADOS

Los resultados de la cuantificación de linfocitos T CD4+ en los distintos grupos de infectados con VIH, se muestra en la tabla 2. Al comparar las medias del grupo SIDA con el resto de los grupos VIH estudiados, se encontraron diferencias significativas en todas las comparaciones (p < 0,01), tanto en valores relativos como en absolutos, e iguales resultados se encontraron al comparar las medias de todos los grupos estudiados con la del grupo control. Seis de los 31 pacientes clasificados como casos SIDA mostaron valores absolutos de linfocitos CD4 superiores a 200 cel/m L (tabla 3). Este hecho podría explicarse por la linfocitosis relativa observada en estos 6 pacientes. Sin embargo, se detectaron 9 portadores de VIH con valores de linfocitos CD4+ iguales o inferiores al 14 % y a 200 cel/m L y en esta tabla también se muestran las frecuencias (número de pacientes) y el porcentaje que éstos representan al agruparlos según el resultado del recuento de los valores absolutos de linfocitos CD4+. En la tabla 4 se muestran la especificidad, sensibilidad y los VPP y VPN encontrados al aplicar este método.

TABLA 2. Linfocitos CD4+ en portadores de VIH, pacientes con SIDA y grupo control. Sanatorio Santiago de las Vegas, Cuba, 1994

 Grupo
N
CD4
X±DE
Rango
II
35m L
941,58
609,90
148
-
4124
 
%
33,25
12,87
12
-
65
III
33m L
915,54
545,30
113
-
2117
 
%
35,15
13,76
13
-
63
IV
61m L
668,18
409,60
87
-
2001
 
%
27,80
11,34
3
-
42
IV-C1
31m L
149,19
161,75
0
-
664
 
%
10,32
8,30
0
-
30
Control normal
26m L
1255,77
389,01
718,08
-
2263,20
 
%
49,50
6,44
40
-
65
 

TABLA 3. Resultados de la cuantificación de linfocitos CD4+ en valores absolutos (cel/m L) en los pacientes con SIDA, clasificación CDC 1986 y en otros portadores de VIH
 
Casos estudiados
Conteo de células -CD4+ m
SIDA
Portadores
Total
%
% acumulado
³ 500
1
170
171
65,7
65,7
200 - 499
5
50
55
21,2
87,0
< 200
25
9
34
13,1
100,0
Total
31
229
260
100,0
100,0
 

TABLA 4. Sensibilidad, especificidad y valor predictivo del UMICIQ para la cuantificación de los linfocitos CD4+ en casos clínicos con SIDA

 

Sensibilidad 80,6 %
Especificidad 95,7 %
Valor predictivo positivo 73,5 %
Valor predictivo negativo 97,3 %
 

DISCUSION

En un estudio semejante a éste realizado en los Estados Unidos,3 se obtuvieron frecuencias similares a las muestras en lo que respecta al número de pacientes cuyas cifras de linfocitos CD4 se encontraban por debajo de 200 cel/m L. Sin embargo, el porcentaje de pacientes con cifras de linfocitos CD4+ entre 200-500 cel/m L es muy inferior en nuestro estudio, lo que podría estar influido por la atención médico-social prestada a los portadores de VIH acogidos al tratamiento sanatorial en el SSV y el IPK. Debemos señalar que el método aplicado en el presente estudio, brinda un gran número de ventajas, como son: requerimiento mínimo de células (sólo el 4 % del número de células necesarias en otros métodos que persiguen iguales objetivos); no necesita microscopio UV, ni citómetro de flujo; permite realizar 21 determinaciones en una lámina portaobjeto y posibilita la distinción morfológica celular. Al referirnos a las ventajas económicas de este método es importante destacar que el anticuerpo monoclonal anti-CD4 (ior-t4) producido en Cuba por la firma CIMAB SA, tiene un comportamiento similar al producido por la Ortho Diagnostic Systems (EUA), y para hacer patente el ahorro económico que re-presenta esta técnica, se debe decir que con un bulbo del preparado norteamericano (1 mL) con un costo aproximado de US 120 se pueden realizar 200 determinaciones mediante microscopía UV o citometría, mientras que por UMICIQ se podrían realizar 1 600 determinaciones con ior-t4, cuyo costo es de $125,00 MN (1 mL), o 200 determinaciones por inmunofluorescencia indirecta (IFI).

Si se tiene en cuenta la sensibilidad, la especificidad y el VPP del UMICIQ, para la cuantificación de linfocitos T CD4+ en portadores del VIH, este método es útil para evaluar a los pacientes y clasificarlos según la definición ampliada de caso SIDA de 1993 (que incluye a aquéllos asintomáticos con valores de CD4+ < 200 cel/m L). En un estudio previo se comparó el UMICIQ con la IFI en controles normales (donantes de sangre) y se encontraron resultados que no diferían estadísticamente para los marcadores CD2, CD3, CD4 y CD8.12 Por otra parte, otros autores han comparado las cifras de linfocitos evaluados con IFI en microscopio UV con la citometría de flujo y tampoco se han encontrado diferencias estadísticamente significativas,15 por lo que se podría pensar que el valor analítico del UMICIQ es similar al de la citometría de flujo, pero para poder llegar a conclusiones en este sentido, será muy útil la realización de un estudio de validación comparativa de ambos métodos.

SUMMARY

The immunocytochemical ultramicro method was applied for the quantitation of T CD4+ lymphocytes in carriers of the human immunodeficiency virus (HIV-1) and in patients presenting with AIDS. Two hundred and sixty HIV carriers from Santiago de las Vegas sanatorium and "Pedro Kourí" Institute of Tropical Medicine, as well as 26 normal controls were studied. From 260 infected patients, 35 were from group II, 33 from group III, 61 from group IV, and 31 were classified as AIDS cases (IV-C1) (Classification from the CDC, 1986). Comparisons between groups were performed using the Student t test. Statistical differences were found in both relative values (%) and absolute values (cel/ L) when comparing the means of T 6D4+ lymphocyte values; only 6 out of 31 AIDS patients showed T CD4+ lyphocyte values greater than 200 cel/ L. This quantitation method allows, in an economic, sensible and specific way, to detect HIV carriers with values of T CD4+ lymphocytes lower than 200 cel/ L and classify them according to the broad definition of AIDS case from the CDC, 1993.

Key words: IMMUNOHISTOCHEMISTRY/ methods; CD4-POSITIVE T- LYMPHOCYTES; ACQUIRED IMMUNODEFICIENCY SYNDROME; HIV INFECTION.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

  1. Centers for Disease Control. 1993 revised classification system for HIV infection and expanded surveillance case definition for AIDS among adolescents and adults. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1992;41(RR-17):1-11.
  2. . Revision of the CDC survillance case definition for acquired immunodeficiency syndrome. MMWR Morf Mortal Wkly Rep 1987;36:1-155.
  3. Lifson AR, Hessol NA, Buchibinder SP, Holmberg SD. The association of clinical condition and serologic test with CD4+ lymphocyte counts in HIV-Infected subject without AIDS. AIDS 1991;5:1209-15.
  4. Reddy MM, Grieco MH. Quantitative changes in T helper induced (CD4+CD45 RA) subsets in human immunodeficiency virus infection. J Clin Lab Anal 1991;5:96-100.
  5. Gougeon ML, Montagnier L. New concepts in the mechanism of CD4+ lymphocyte depletion in AIDS and the influence of oportunistic infections. Res Microbiol 1992;143:362-8.
  6. Fournier AM, Sosenko JM. The relationship of total lymphocyte count to CD4 lymphocyte counts in patients infected with human immunodeficiency virus. Am J Med Sci 1992;304:79-82.
  7. Reddy MM, Guetz RR, Gorman JM, Grieco MH, Chess L, Lederman S. Human immunodeficiency virus type-1 infection of homosexual men is accompained by a decrease in circulaiting B cells. J Acq Immu Defic Syndr 1991;4:428-34.
  8. Peiperl L. Manual of HIV/AIDS Therapy. Fountain Valley, Current Clinical Strategies, Publishing International, 1993.
  9. Centers for Disease Control. Classification system for human T-lymphotropic virus type III/Lymphoadenopathy-associated virus infections. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1986;35:334-9.
  10. Kranz BR, Thierfelder S. Improved detection of terminal transferase (TdT): use of detergents on glutaral-dehyde-fixed non-dehydrated cells prevents denaturation and diffusion artifacts. Leuk Res 1986;10:1041-9.
  11. Kranz BR, Thierfelder S. Immunocytochemical identification of meningeal leukemia and lymphoma: poly-L-lisine-coated slides permit multimarker analysis even with minute cerebroespinal fluid cell Specimens. Blood 1989;73:1942-50.
  12. Rivero R, Bello M, Suárez L, Cruz C, Martínez M, Palma L. Introducción de un ultramicrométodo inmunocitoquímico para la cuantificación de subpoblaciones linfocitarias identificadas con anticuerpos monoclonales. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 1995;11(1):46-56.
  13. Cruz C, Rivero R, Suárez L. Detección mejorada del antígeno CD2 por un ultramicrométodo inmunocitoquímico en células T no-deshidratadas unidas a láminas recubiertas con poli-L-lisina y fijadas con vapores de formaldehído. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 1995;11(1):71-2.
  14. Suárez L, Cruz C, Rivero R. Ultramicrométodo inmunocitoquímico: titulación de anticuerpos primarios y antisueros conjugados. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 1995;11(1):57-62.
  15. Landay A, Larry G, Abo T, Cooper MD. Enumeration of human lymphocyte subpopulations by immunofluorescence metry and fluorescence microscopy. J Immunol Methods 1983;58:337-47.
  Recibido: 11 de agosto de 1995. Aprobado: 19 de septiembre de 1995.

Lic. René A. Rivero Jiménez. Instituto de Hematología e Inmunología. Apartado 8070, CP 10800, Ciudad de La Habana 8, Cuba.

Indice Anterior Siguiente