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Generación de hidromas secretores de anticuerpos monoclonales anti-fibronectina humana plasmática
Generation of hidromas secretory of antibodies monoclonal plastic human antifibrous
Dr. Roberto Bolaños Escofet 1, Lic. Ubaldo Torres Romo 2,
Dra. María Lina Jiménez Pardo 3, Dra. Nilda Sánchez Treto 4,
Téc. Nury Benítez Rosales 5, Téc. Yudith Hernández González 6.
RESUMEN
Se obtuvieron cuatro anticuerpos monoclonales secretados por
hibridomas generados mediante la fusión del mieloma P3/x63.Ag8.653
con linfocitos esplónicos de ratones inmunizados con fibronectina purificada
a partir del plasma humano.
Se seleccionó el anticuerpo monoclonal F1Fn-R/1-B2/A1 para realizar
los estudios de especificidad de este tanto por la molécula utilizada
como antígeno como por la que se encuentra en el plasma.
Se demostró que el anticuerpo monoclonal
reconoce la molécula de fibronectina plasmática humana.
PALABRAS CLAVE: FIBRONECTINA, HIBRIDOMA, ANTICUERPO MONOCLONAL.
1. Doctor en Medicina Veterinaria
2. Profesor de Bioquímica
3. Profesora de Agentes Biológicos
4. Profesora de Anatomía Humana
5. Técnica en Procesos Biológicos
6. Técnica en Higiene
Facultad de Ciencias Médicas. Circunvalación Norte y Carretera de
Morón.Ciego de Avila 65 200. Cuba
E-mail: roberto@cpcmca.sld.cu
INTRODUCCION
La glicoproteína fibronectina (FN) se conoció
en 1948 como un contaminante del
fibrinógeno del plasma. Se pudo aislar mediante el método de
fraccionamiento frío de Cohn's, y como se precipitaba a 4 grados
Celsius, el nombre original fue globulina fría insoluble (1). Más
tarde fue caracterizada y se encontró que
era el mayor componente del plasma humano
(2). Su nombre en latín significa fibras de enlazamiento ya que es capaz de
unirse a fibras cológenas de tejido conectivo (3).
Se encuentra en dos formas: una soluble
presente en el plasma a una concentración de 0.3 mg/ml
y otra altamente insoluble, llamada fibronectina celular o
de tejido asociada, la cual timolecular compuesto por dos subunidades
unidas por puente disulfuro con pesos
moleculares aproximadamente de 230.000
y 250.000 Daltons (5).
Se ha reportado que la FN está
directamente envuelta en ciertos mecanismos de defensa del hospedero
funcionando como una opsonina no inmune que
ayuda al sistema retículo endotelial a eliminar los
restos de células, bacterias y agregados de hongos. Se
sugiere que estimula la producción
de interleuquina 1 por los monocitos (6).
En tejidos humanos normales la
inmunoreactividad de la FN se presenta como
pequeños filamentos de tejido conectivo extracelulares y de membranas basales
(7).
El papel de la FN en los procesos malignos de
la mama ha sido ampliamente estudiado. Ensayos
in vitro han demostrado que se produce FN en células,
malignas y benignas, de epitelio mamarios de ratón, rata y
humanos en cultivos , y además, estos mismos tejidos, mostraron
inmunoreactividad para esta glicoproteína por métodos de
tinción inmunocitoquimicos (8).
La inmunoreactividad de la FN
demostrada en células epiteliales de mama in vivo ha sido
un gran hallazgo, la reacción más intensa se ha
observado en células tumorales con crecimiento individual y en
poblaciones celulares de carcinomas iferenciados,así como,en células
metastésicas de nódulos linfáticos (9).
En nuestro país no existen reportes de anticuerpos monoclonales
(AcM) contra la FN. En los últimos años, se
comercializan, en varias casas, productos que
pueden emplearse en técnicas de inmunohistoquimica para la
detección de FN en células en cultivo,
secciones de tejido congelado y como
un marcador discriminante entre
carcinomas invasivos pequeños y lesiones
proliferativas benignas de mama. También para la cuantificación
de esta molécula por inmunodifusión radial,la inmunofijación
y determinación por electroforesis de esta proteína en el
suero.Se oferta,además, como una fracción de inmunoglobulina G
(IgG) anti-fibronectina conjugada con peroxidasa.
El objetivo del trabajo consiste en obtener hibridomas
secretores de AcM que reconozcan a
la fibronectina humana plasmática.
MATERIALES Y METODOS
Antígeno:
El extracto antigénico de FN humana plasmática con una concentración
de proteínas de 1500 ug/ml fue
suministrado por el Instituto Nacional de
Hematología e Inmunología.
Inmunización:
Se realizaron dos esquemas de
inmunización con 4 grupos de seis ratones Balb/c hembras de seis
a ocho semanas de edad y peso
corporal entre 22 y 24 g. En los grupos I y II se empleó el
método escrito por Williams y colaboradores (10) y en los
grupos III y IV un esquema de inmunización tópico (11, 12). ( Tablas 1 y 2 ).
Fusión,cultivo y clonaje de hibridomas:
Se realizaron dos fusiones independientes,siguiendo los principios
básicos descritos por Kohler y Milnstein (13) con algunas
modificaciones (14) . Las células esplónicas se
hibridizaron en proporción 10:1 con el
mieloma P3/x63.Ag8.653,empleando polietilenglicol y se sembraron en
placas de 96 pozos (Nunc), a una concentración de cien mil
células por ml de medio, y 150 ul por pozo. El medio de
cultivo selectivo empleado fue DMEM-F12 ( 1:1
) (Sigma Chemical Company ),
suplementado con 10% de suero fetal de ternera ( Tecnomara ), 26 mM de bicarbonato
de sodio, 18 mM de HEPES, 2 mM de L- glutamina, 1
mM de piruvato de sodio, 0.05 mM de 2-mercaptoetanol y antibiótico,
al cual se le añadió hipoxantina hasta 0,03 mM, timidina hasta 3
uM y aminopterina hasta 0.4 uM.
A los 14 días se eliminó
la aminopterina del medio, y se
comenzó el ensayo de anticuerpos en los sobrenadantes de los cultivos de
hibridomas que exhibían buen crecimiento.Los cultivos de
hibridomas secretores de anticuerpos específicos se clonaron y
reclonaron por dilución limitante,y se expandieron
progresivamente para su criopreservación e inoculación a ratones.
Ensayo inmunoenzimático tipo ELISA para la detección de
anticuerpos en los animales inmunizados y cultivos de hibridomas:
Se desarrolló un método de captura de anticuerpos
en placa de 96 pozos, la determinación se llevó a
cabo por un sistema ultramicroanalítico. Se recubrieron las placas
durante 12 horas, a 4 grados Celsius con 10 ul por pozo, de una
solución cuyo contenido era 5 ug de FN por ml de tampón
de recubrimiento. Las placas se lavaron y
se añadió 10 ul de suero de ratón o sobrenadante de cultivos de hibridomas a cada
pozo. Después de una hora a 37 grados Celsius, las
placas se lavaron y se incubaron una
hora con el conjugado anti-inmunoglobulina de ratón en conejo
con fosfatasa alcalina. Después de
tres lavados,se adicionó el sustrato y se
dejó reaccionar 30 minutos a temperatura ambiente.
Purificación del AcM:
La purificación del AcM a partir de líquido ascético se
realizó por cromatografía de afinidad con
Proteína A Sepharosa (Pharmacia).
Ensayo de especificidad de los AcM por immunoblotting.
Electroforesis:
Se utilizó SDS-PAGE en PhastGel, gradiente
10-15 con tampones discontínuos, donde
se corrieron muestras de FN pura y plasma humano preparados sin
inclusión de 2-mercaptoetanol en el tampón
de muestra.
Immunoblotting:
Las proteínas separadas
por electroforesis fueron transferidas a una membrana
de nitrocelulosa (NC). Luego del bloqueo, con leche descremada al 4%
durante una hora, se incubaron los
anticuerpos durante 18 horas a 4
grados Celsius. Posterior al lavado, se añadió la
anti-inmunoglobulina de ratón en conejo biotinilada 1:1000 (Dakopatts) 1
hora a 37 grados Celsius,luego del lavado,se adicionó
el complejo avidina/biotina (Dako) 1 hora a 37 grados Celsius y después
de un último lavado, la reacción se
reveló al añadir el sustrato 3-Amino-9-ethylcarbazole (AEC)
(Sigma Immuno Chemical).
Cuantificación de inmunoglobulina G (IgG):
Se cuantificó por el sistema
inmunoenzimático de fase sólida que se produce en el
Centro de Inmunología Molecular.
RESULTADOS Y DISCUSION
De los esquemas de inmunización empleados
resultó el que se aplicó a los grupos de animales III y IV, donde
se obtuvo títulos de anticuerpos
desde 1:5000 hasta 1:20 000. En los grupos I y II los
títulos de anticuerpos fueron inferiores
a 1:1000. Estos resultados no
coinciden con los de Williams y colaboradores (10),
quienes utilizaron el esquema para obtener anticuerpos
de alta afinidad.
De los grupos III y IV
se seleccionó el animal de mayor título
para llevar a cabo la fusión celular. Diez días después,
se evaluó la misma, los resultados se muestran en la tabla 3. Los
cuales coinciden con reportes anteriores y superan otros resultados. Valores
de eficiencia de fusión superiores al 60% son considerados como
muy satisfactorios (12, 15).
El tamizaje de los 234 pozos, donde se observó crecimiento de
células híbridas concluyó con la selección de ocho
hibridomas altamente secretores de anticuerpos anti-fibronectina
humana, el hibridoma F1Fn-R/1-B2 se sometió a un primer clonaje,
donde el 100% de los clones obtenidos secretaban
anticuerpos específicos.El hibridoma F1Fn-R/1-B2/A1 seleccionado se
sometió a un segundo clonaje y se
obtuvieron resultados iguales al anterior, lo que demuestra su
monoclonalidad (12). Por último, se eligieron
cuatro hibridomas para la confección de un
banco de trabajo y posterior caracterización.
Los valores de cuantificación de IgG se muestran en
la tabla 4.
Con los resultados obtenidos del inmunoblotting
se demostró la especificidad de reconocimiento del
AcM.Al enfrentarlo a la fibronectina y al plasma humano se observó una
sola banda que se corresponde, en ambos,
con el patrón de 340 000 Daltons.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1.Morrison PR, Edsall JT, Miller SG. Preparation and
properties of serum and plasma proteins XVIII.The separation of
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Absence of fibronectin and presence of plasminogen
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Fibronectin and laminin expression in breast cancer
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48:499-505.
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Immunopathol 1989; 24:267-283.
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de cancer mamario humano en la obtención de anticuerpos monoclonales que
reconocen tejido tumoral. Interferón y
Biotecnología 1986; 3:125-138.
12.Gavilondo J. Manual teórico-práctico sobre
tecnología de obtención y producción de
anticuerpos monoclonales murinos. CIGB: C. de la Habana, 1988.
13.Kohler G and Milnstein C.
Continuos cultures of fused cells secreting antibody
of predefined specificity. Nature 1975; 256:495-497.
14.Sorell L, Fernández ME, Penton E,Lopez J,Perez
IC.Producción y características de anticuerpos monoclonales contra lipoproteínas
que contienen apoproteína. B.Interferón y
Biotecnología 1986; 3:239-241.
15.Freyre M., et al. Anticuerpos monoclonales que reconocen
los factores de crecimiento epidérmico humano y
murino.Interferón y Biotecnología 1989; 6(1):32-43.
ANEXOS
Tabla 1. Esquema de inmunizaci¢"n empleado en los
grupos I y II
------------------------------------------------------------
Subgrupo A: Donantes de esplenocitos.
DIA 0: InoculaciÓn de 100 g de FN + ACF, 0.2 ml,IP.
------------------------------------------------------------
Subgrupo B: Receptores de esplenocitos.
DIA 27: IrradiaciÓn con 600 rads de Cobalto-60
------------------------------------------------------------
Subgrupo A:
DIA 28: Sacrificio y obtenciÓn de esplenocitos.
------------------------------------------------------------
Subgrupo B:
DIA 28: Trasplante de 20 millones de cÉlulas + 25 g de FN,
------------------------------------------------------------
DIA 33: SangrÍa. EvaluaciÓn de tÍtulos.
------------------------------------------------------------
Dia 34: FUSION.
------------------------------------------------------------
Tabla 2. Esquema de inmunizaciÓn empleado en los grupos II
IV
_________________________________________________________
DIA DOSIS ADYUVANTE VIA DE ADMON.
_________________________________________________________
0 100 COMPLETO 0.2 ml IP
7 100 INCOMPLETO 0.2 ml IP
14 100 INCOMPLETO 0.2 ml IP
17 SANGRIA-EVALUACION DE TITULOS
21 50 - 0.1 ml IV
24 FUSION
_________________________________________________________
Tabla 3. EvaluaciÓn de la fusión
----------------------------------------------------------
Pozos sembrados Pozos con ceacimiento %
de híbridos
Eficiencia
----------------------------------------------------------
288
234
81.25
----------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------
No de hibridomas Primer clonaje Segundo clonaje seleccionados
Tabla 4. Resultados de la cuantificación de IgG de
los
sobrenadantes de cultivo metabolizado correspondientes a los
hibridomas seleccionados
------------------------------------------------------------
AcM Hibridoma IgG (ug/ml)
------------------------------------------------------------
1 1B-2/A1/A11 9.55
2 1B-2/A1/C2 10.70
3 1B-2/A1/C10 9.90
4 1B-2/A1/F7 10.30
------------------------------------------------------------ |