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Rev Cubana Med Milit 2004;33(2)

Hospital Militar Central "Dr. Luis Díaz Soto"

Utilidad de técnicas histológicas para el diagnóstico de infección en piezas anatómicas

My. Verónica Walwyn Salas,1 Dra. C. Magaly Iglesias Duquesne,2 Tec. María Rosa Almarales,3 Dr. Néstor Acosta Tieles,4 Dra. Ana Mera Fernández5 y Dra. María Ofelia Cabrejas Acuña5

Resumen

Se realizó un estudio en el Departamento de Anatomía Patológica del Hospital Militar Central "Dr. Luis Díaz Soto" entre enero a julio de 2002, para la introducción y el montaje de técnicas histológicas de coloraciones especiales más empleadas en los centros especializados del país, en el Instituto "Pedro Kourí" (IPK) y el Hospital Pediátrico "Aballí", con el objetivo de identificar los distintos tipos de gérmenes nosocomiales a nivel celular en muestras de biopsias, citología y necropsias. Estas técnicas histológicas especiales como son verde metilo pironina, Gleen, Gram, plata metenamina, entre otras, con el objetivo de elevar la calidad de los diagnósticos histológicos en biopsias, citología y necropsias en relación con las infecciones nosocomiales, además de realizar modificaciones de algunas de las técnicas histológicas especiales que permiten mejor su identificación. Los resultados del montaje de estas técnicas posibilitan un diagnóstico histológico específico del germen causal de la sepsis, lo que permite una rápida aplicación de conductas preventivas y terapéuticas al paciente.

Palabras clave: infección; infección nosocomial; técnicas histológicas; diagnóstico de infección.

Aún con los innumerables avances de la medicina moderna, el uso de antimicrobianos en el decenio de 1930, se puede decir que las infecciones no han podido ser eliminadas, por el contrario, muchos de estos agentes han cambiado conjuntamente con los adelantos científico-técnicos.

En la actualidad la biología molecular logra identificar cepas de virus, bacterias y parásitos que han revolucionado estudios en hospitales y en el medio ambiente. Los estudios histológicos con técnicas histológicas convencionales y especiales le brindan una información básica al clínico acerca de la naturaleza del proceso infeccioso, etc., lo que permitiría su aplicación y contribución a elevar la calidad diagnóstica en casos de infiltrado inflamatorio agudo, inflamación aguda, etc. e informar el agente causal de infección, por la morfología, forma de agrupación y características clínicas e histología, de ahí la importancia de introducir y aplicar estas técnicas histológicas con una nueva visión de calidad diagnóstica, lo que suple la falta de recursos de costosas técnicas como es la reacción en cadena a la polimerasa (PCR). Se debe señalar que existe limitación en el diagnóstico histológico, pues si bien se puede conocer al agente causal, no es posible llegar a determinar la cepa ni la resistencia a los antibióticos, esto solo a través del diagnóstico microbiológico.

El hallazgo histológico de microorganismo en tejido viable es altamente específico, así como el diagnóstico de infección.1 De ahí el objetivo del estudio es mostrar las posibilidades de la utilización de técnicas histológicas convencional y especial para los diagnósticos de gérmenes causantes de infección.

Métodos

Se realizó un montaje de técnicas histológicas más usadas para el diagnóstico de gérmenes causales de infección: técnica histológica convencional de hematoxilina/eosina, de origen vegetal, extraída del palo azul de campeche, el azul de azafrán, el índigo y la orseína. Esta técnica vino a sustituir al azul de metileno, siendo un colorante básico nuclear que colorea al núcleo de azul, y la eosina es un colorante ácido que colorea al citoplasma de rojo a rosado.2,3

Las coloraciones histológicas especiales, como son: el Pas,2,3 Zielh Nielsen,2,3 Brown Brenn,2,3 verde metilo pironina,2,3 Glenn,2,3 Griedley,3 Mucicarmin,2,3 Levaditis,2,3 Waysson,2,3 Warthin Starry,2,3 técnica de plata metenamina,4-7 Giemsa,8,9 Gram,8,9 identifican estructuras específicas en los tejidos, en estos casos el tipo de agentes infecciosos, la forma de agrupación, daños que provocan en otras estructuras como son vasos sanguíneos, tejido intersticial, etc. (cuadros 1 y 2).

CUADRO 1. Técnicas histológicas según grupo de agentes infecciosos y forma de identificación

CUADRO 2. Identificación de gérmenes según tipo de agente causal y técnica histológica empleada

Nota: Con la hematoxilina/eosina (H/E) se ven bien aquellos gérmenes que están marcados.

Algunas de estas técnicas se han modificado como son: la técnica de plata metenamina, cuando se trata de identificar bacterias se le da un tiempo de 30 min y no de 45 a 60 min como es lo habitual.2,3 La técnica de Brown Brenn que es específica para bacterias, la modificación está en omitir el éter.2,3 Existen otras modificaciones en técnicas como es la plata metenamina para teñir Clostridium y Escherichia coli. La técnica de Glenn para bacterias, se modifica al emplear para la preparación 30 s para la Fuscina de Glyn y 1 min para el carbol cristal violeta. En la técnica de Giemsa la modificación está en sustituir el colorante de Jenner por rojo nuclear rápido y no utilizar alcohol absoluto para la deshidratación, sino la desecación al calor por vía natural.

La validación de estas técnicas para el diagnóstico histológico de germen causal de infección utilizó muestras de tejidos humanos sugestivos de infección en órganos como pulmón, hígado, cerebro, vesícula biliar, cordón umbilical, piel y otros, obtenidos mediante biopsias y necropsias realizadas en el Departamento de Anatomía Patológica del Instituto Superior de Medicina Militar "Dr. Luis Díaz Soto". También se revisaron las historia clínicas, la boletas de biopsia y cultivos.

Se han realizado reevaluaciones con procederes histológicos nuevos para valorar la seguridad de la prueba en biopsia fijada en solución de Carnoy's, seguida por inmunohistoquímica, las que se comparan con las muestras histológicas fijadas en formol al 10 % y coloreadas con hematoxilina/eosina, lo que demostró tener mayor sensibilidad que el método convencional.10,11

Resultados

En las muestras estudiadas sugestivas de infección por hematoxilina/eosina se observó la presencia de infiltrado inflamatorio agudo, con presencia de necrosis, exudado purulento, presencia de gérmenes en la luz de algunos vasos. Estos órganos fueron pulmón, cerebro, riñón, cordón umbilical, vesícula biliar, etcétera.

Se observaron lesiones ampolladas y costrosas en la piel y se procedió a realizar estudio citológico de estas, en las que se encontraron inclusiones virales. Se realizó punción biópsica a lesiones tumorales que por las características del material aspirado se sospechó de origen infeccioso y se determinó la presencia de bacterias gramnegativas. En ellas se realizó coloraciones especiales y se agruparon, mostrando los órganos con la coloración (cuadro 3).

CUADRO 3. Relación de órganos muestreados con las técnicas empleadas

En los cuadros 3 y 4 se muestra la aplicación de técnicas histológicas convencionales y especiales que brindan posibilidad al patólogo de especificar el germen causal de infección al emitir un diagnóstico.

CUADRO 4. Relación del germen por histología con las coloraciones especiales

En el cuadro 4 se relacionan los gérmenes por estudio histopatológico de acuerdo con la forma de agrupación y coloración; se observa en su gran mayoría que son bacterias Gram, gramnegativas, hongos, virus y parásitos, y se especifica en cada caso la tinción empleada.

El cuadro 5 establece la correlación entre el germen diagnosticado por histología y el cultivo microbiológico realizado a 4 de los casos estudiados.

CUADRO 5. Relación del diagnóstico morfológico con cultivo positivo

Discusión

La hematoxilina/eosina, técnica histológica convencional, vino a sustituir al azul de metileno considerado un colorante básico nuclear que colorea al núcleo de azul, y la eosina, colorante ácido que colorea al citoplasma de rojo a rosado.2,3

Las técnicas histológicas especiales que se seleccionaron para este estudio fueron las siguientes:
el ácido periódico de Schiff (PAS), colorea los hidratos de carbonos, glucógenos, mucopolisacaridos neutros, mucoproteínas, membrana basal, los hongos y pigmentos férricos.2,3

El Zielh Nielsen sirve para identificar bacilo de Koch. Otros autores utilizan para los bacilos ácidos alcohol resistente el PCR, lo que demuestra una alta sensibilidad en el diagnóstico de micobacteria.4,5

La plata metenamina se usa para hongo aunque tienen otros usos como para el diagnóstico histológico de la membrana basal en biopsia renal.4, 6,7

Las técnicas de verde metilo pironina, Brown Brenn y la plata metenamina se usan como rutina en algunos laboratorios en los casos cuando se sospecha etiología infecciosa.2,3

El Gram es la técnica especial más utilizada para detectar gérmenes grampositivos y gramnegativos además de permitir diferenciarlos. El uso y difusión de esta técnica ha sido recomendada por León como método rápido y fácil en la detección de bacteriemia relacionada con el catéter en pacientes críticos. Las técnicas de Giemsa modificada son eficaces para los grampositivos.8,9

La técnica de verde metilo pironina fenicada también utilizada para estos fines, identifica solamente a gérmenes gramnegativos, de color rojo vivo y los núcleos verde azuloso.2,3

La técnica de Levaditis para espiroquetas tiene dentro de sus componentes el nitrato de plata que identifica bacterias.2,3

Las técnicas Warthin Starry y el Waysson son utilizadas con frecuencia en biopsias gástricas, para detectar el Helicobacter pylori. Autores realizaron reevaluación con procederes histológicos nuevos para valorar la seguridad de la prueba en biopsia fijada en solución de Carnoy's, seguida por inmunohistoquímica, las que se comparan con las muestras histológicas fijadas en formol al 10 % y coloreadas con hematoxilina/eosina, lo que demostró tener mayor sensibilidad que el método convencional.10,11 Cohen utilizó una nueva técnica en la que plantea que es más rápida, menos costosa, fácil de realizar e interpretar y con una sensibilidad comparable a métodos de coloración convencional, que consiste en usar PAS, solución de Coleman's Feulgen, hematoxilina de Mayer y azul de metileno, que tiñe los microorganismos de azul brillante y puede ser completada en pocos minutos.12

La técnica Gridley identifica hongos y Endoameba histolítica.3,13-15

La técnica de Mucicarmin de Mayer se utiliza generalmente para mucoproteínas y Criptococcus y se usa fundamentalmente en centros especializados y en infecciones oportunistas.2,3

En la actualidad existen estudios de análisis genómico del virus que se usan con frecuencia;16 otros autores lo han utilizado para confirmar el diagnóstico de infección por CMV, la detección inmunohistológica de proteína estructural y la hibridización in situ.17 Otros autores han usado esta última para detectar el virus de la enfermedad de Jembrana en cortes embebidos en parafina.18

Hay estudios en los que se utilizaron inmunocoloración con anticuerpo anti Mycobacterium (BCG), para una rápida detección de virus, protozoarios, hongos y bacterias en muestras de piel fijada en formalina.19

Para diagnosticar parásitos usualmente se utiliza la técnica de Giemsa, aunque se puede emplear otras coloraciones como es la técnica de cito concentración para parásitos sanguíneos, la cual tiene un bajo costo y ofrece la posibilidad de aislar e identificar en el mismo sedimento el parásito principal con excepción de los trofosoitos jóvenes y el Plasmodium falciparum.20

Es importante conocer el tipo de sala, si el paciente está inmunocomprometido o no, conocer el mapa microbiológico de cada sala, si el paciente es oriundo del área geográfica donde se encuentra enmarcado el hospital, o si procede de otra zona o país, ya que es necesario estar documentado de las enfermedades infecciosas emergentes y reemergentes que han surgido en esa etapa. De ahí el valor de la interpretación del patólogo que no se limite al diagnóstico de inflamación sino a informar el agente causal de la infección productor del cuadro clínico y de la enfermedad planteada.

Se debe tener en cuenta que se agrupan algunas bacterias patógenas para el hombre que de acuerdo con las características tintoriales se puede llegar a la conclusión del tipo de agente causal, es decir, si se está en presencia de germen grampositivo o gramnegativo, dado que en caso de gérmenes gramnegativos las paredes celulares están formadas por 2 capas de fosfolípidos con una capa de proteoglicano y en los gérmenes grampositivos por una bicapa recubierta por peptidoglicanos. Otro ejemplo es en los casos del diagnóstico de los virus que se identifican por microscopia electrónica, además de poder utilizarse técnicas histológicas como es la hematoxilina/eosina que visualiza las inclusiones virales y diagnosticar tipos de virus como son el citomegalovirus (CMV), papiloma virus y el virus de Epstein Barr.21

La utilización de técnicas histológicas convencionales y especiales posibilita determinar la presencia del agente causal de infección a nivel celular, lo que propicia emitir un diagnóstico de infección más discriminativo y de mayor calidad por el Especialista en Anatomía Patológica. Se debe implementar por los departamentos de Anatomía Patológica la utilización y montajes de aquellas técnicas que permitan elevar la calidad diagnóstica de infección en biopsias, citología y necropsias.

Summary

A study on the introduction and mounting of the most used special histological techniques of staining in specialized domestic institutions, in "Pedro Kourí" Institute and "Aballí" Pediatric Hospital, to identify the different types of nosocomial germs at cellular level in samples taken from biopsies, cytology and necropsies, was performed. These special histological techniques such as methyl green pyronine, Gleen, Gram, metenamine silver, among others were studied to raise the quality of histological diagnosis in biopsies, cytology and necropsies as far as nosocomial infections are concerned in addition to making changes of some of the special histological techniques that better allow the identification. The results of the mounting of these techniques facilitate specific histological diagnosis of germ causing sepsis, which allow the application of preventive and therapeutical methods to the patients.

Key words: nosocomial infections; histological techniques; infection diagnosis.

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Recibido: 7 de enero de 2004. Aprobado: 30 de enero de 2004.
My. Verónica Walwyn Salas. Hospital Militar Central "Dr. Luis Díaz Soto". Avenida Monumental, Habana del Este, CP 11700, Ciudad de La Habana, Cuba.

1 Especialista de I Grado en Anatomía Patológica. Profesora Asistente.
2 Doctora en Ciencias Médicas. Profesora Titular.
3 Técnica en Anatomía Patológica.
4 Especialista de II Grado en Anatomía Patológica. Profesor Titular
5 Especialista de I Grado en Anatomía Patológica.

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