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Rev Cubana Oncol 1996;12(2)
Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología

Función citotóxica natural y subpoblaciones linfocitarias en pacientes con cáncer de colon

Dr. Tomás Miguel Díaz Román,1 Lic. Marta Elena Guerra Yi2 y Dra. María Elena Faxas García3

RESUMEN

Se analizó la acción de las células citotóxicas naturales en un grupo de pacientes con neoplasias de colon frente a las líneas celulares Sw-948 y K-562. Se obtuvieron valores de dos tiempos de incubaciones distintos (4 y 18 horas) y se estudiaron además los marcadores fenotípicos de membrana CD3, CD4, CD6, CD8 y HLA-DR, en células linfoides de sangre periférica. Los resultados se compararon con los de un grupo control; sólo el grupo de pacientes mostró un incremento significativo de la actividad citotóxica al pasar de 4 a 18 horas de incubación para ambas líneas celulares, a su vez este grupo expresó niveles bajos de linfocitos CD3 + CD6+. Se encontró una correlación positiva entre estos dos marcadores y la actividad citotóxica.

Palabras clave: NEOPLASMAS DEL COLON/inmunología; CARCINOMA/inmunología; DONADORES DE SANGRE.

INTRODUCCION

Las células tumorales expresan antígenos (ags) de forma diferente a las células normales, contra estos, el sistema inmunológico pude desarrollar una respuesta. En los tumores sólidos la inmunidad celular se considera de máxima importancia, uno de sus componentes son las células citotóxicas naturales NK. La función de las células NK usualmente se evalúa en ensayos de citotoxicidad. Estos ensayos miden la capacidad que tienen tales linfocitos de destruir líneas de células adaptadas convenientemente al crecimiento in vitro.

El origen de estas líneas generalmente no está relacionado con la naturaleza del tumor que afecta al paciente en estudio, tal es el caso de las K-562, células de eritroleucemia que con más frecuencia se emplean en estos análisis.1 Las células SW-948 obtenidas de un tumor de colon expresan ags carcinoembrionario en cantidad adecuada y están por consecuencia histológica antigénicamente más relacionadas con estos enfermos.2 Aún cuando las NK no son células de reconocimiento antigéno-específicas sería apropiado probar su actividad en un modelo biológico más cercano a lo que sucede in vivo. Por tal motivo, decidimos hacer un estudio comparativo de la respuesta citotóxica de los enfermos de cáncer de colon ante ambas líneas celulares.

MATERIAL Y METODO

Se obtuvieron células mononucleares a partir de 15 mL de sangre periférica heparinizada, separadas por centrifugación sobre un gradiente de densidad (1,077 g/ml) según el método de Boyun,3 es un grupo de 19 donantes de sangre voluntarios aparentemente sanos, y ocho pacientes con diagnóstico clínico e histológico de carcinoma colo-rectal que no recibieron tratamiento onco-específico ni inmunomodulador alguno durante las ocho semanas previas al estudio. Se emplearon las líneas celulares SW-948 y K-562, cultivadas en medio RPMI 1640 (Lab Flow UK) suplementado con L-glutamina al 5 % (Biochemical BDH chemical LTD. Poole, UK), estreptomicina 50 mg/mL (Mheco-Shenzhen Phar, China) y suero de ternera sin calostro al 10 % (Labiofam, Cuba).

Se realizaron ensayos de citotóxicidad para ambos grupos según la técnica usual.4 Las células blanco se marcaron con Cr51, (solución Amershan UK) y se enfrentaron a las efectoras en distintas proporciones, dispensados en un volumen final de 0,2 mL, por pozo. Se establecieron tiempos de 4 y 18 horas de incubación a 37 oC con atmósfera de CO2 al 5 %. Los sobrenadantes se colectaron y la actividad radiactiva liberada se midió en un contador de radiaciones gamma (LKB. Suecia). Los porcientos de lisis se obtuvieron por la fórmula:

% lisis=(Lm-Le)/(Lt-Le)*100, donde

Lm: media de los conteos por minutos (cpm) de las muestras.
Le: media de los cpm de las lisis espontáneas.
Lt: media de los cpm de las lisis totales.

Los resultados se expresaron finalmente en unidades líticas definidas como la cantidad de células capaces de lisar el 50 % de los blancos por cada millón de células efectoras.

Se realizó el estudio fenotipo de las subpoblaciones linfocitarias por inmunofluorescencia indirecta,5 usando 50 m l de anticuerpos monoclonales anti CD3, CD4, CD6, CD8 HLA-DR en las diluciones de trabajo previamente establecidas: 1/10, 1/20, 1/10, 1/20 y 1/10 respectivamente, y conjugado en dilución de trabajo 1/100 (CIMAB.SA., Cuba). Se procedió al analisis de los datos a través de las pruebas estadísticas adecuadas según el caso, análisis de varianzas y correlaciones lineales, para lo cual se empleó el paquete estadístico SAS versión 6, 1985.

RESULTADOS

El estudio de citotoxicidad no mostró diferencias entre los grupos de pacientes y controles para ningún tiempo de incubación, ni en ninguna línea en particular. Los valores de lisis en el grupo control presentan una tendencia a elevarse con el tiempo de incubación, si se comparan los resultados de la incubación a las 4 y a las 18 horas, aunque no se observa una diferencia estadísticamente significativa para ninguna de las dos líneas celulares. Sólo el grupo de pacientes mostró incremento significativo de la lisis cuando se comparó la actividad de las 4 horas con la de 18 de incubación (p=0,02) (tabla 1).

TABLA 1. Actividad citotóxica natural en controles y pacientes según el tipo de célula diana y los tiempos de incubación

   
Controles
Pacientes
 
 
Tiempo de incubación
X +/- DE
X +/- DE
 
Tipo de célula
(horas)
(n)
(n)
Significación estadística
 
4
1,52+/-1,32
0,86+/-0,63
ns
   
(19)
(8)
 
SW-948        
 
18
2,34+/-1,80
2,76+/-1,00
ns
   
(8)
(8)
 
Significación estadística  
ns
p<0.02
 
 
4
1,76+/-0,91
0,77+/-0,64
ns
   
(19)
(8)
 
K-562        
 
18
2,61+/-2,30
3,69+/-1,63
ns
   
(8)
(8)
 
Significación estadística  
ns
p<0,02
 
ns: diferencias no significativas.

El estudio de los marcadores de la membrana mostró una disminución significativa del valor relativo de células CD3+ y CD6+ (p=0,01) en los pacientes (tabla 2), a su vez estos dos marcadores se correlacionaron positivamente con el incremento de la actividad NK de los enfermos (p=0,86 p=0,01 y p=0,73 p=0,04) respectivamente.

TABLA 2. Subpoblaciones linfocitarias en controles y enfermos
Marcador Controles Pacientes  
(%) X +/- DE X +/- DE Significación estadística
CD3+ 70 +/- 6 46 +/- 14 p < 0,01
CD4+ 45 +/- 6 49 +/- 6 ns
CD6+ 66 +/- 15 55 +/- 12 p < 0,01
CD8+ 26 +/- 7 32 +/- 13 ns
DR+ 13 +/- 7 12 +/- 8 ns
ns: diferencias no significativas.

DISCUSION

El incremento de los valores de citotoxicidad se puede relacionar teóricamente con varias causas: el reciclaje de la acción de las células efectoras sobre las blancos, la activación de las células del paciente por la liberación de factores solubles segregados al medio y la participación de un mecanismo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos que se evidencia más en el tiempo.

El reciclaje de las células NK, que luego de ejercer su acción sobre las dianas quedan capacitadas para volver a entrar a otro ciclo lítico, podría explicar el incremento observado tanto en pacientes como en controles; sin embargo, el aumento es estadísticamente significativo sólo para el grupo de casos en los que debió ocurrir un mayor grado de activación de los mecanismos citotóxicos atribuibles a otras causas.

El aumento de la expresión de moléculas de membrana como se describe para CD11c, CD54, CD58, CD16, CD2, b 2 integrinas e ICAM, CD69, CD71, CD56 y otros, por la liberación de factores como interleuquinas (IL) IL-1, IL-2, IL-12, IL-7 y los interferones (INF), puede conducir al incremento de la capacidad destructora de las células NK.6-9 La expresión de estas moléculas tiene una cinética de aparición y los efectos de algunos de los factores mencionados como el INF-beta y la IL-2 se puede hacer máxima a las seis horas, lo que podría explicar los aumentos de la actividad en nuestros ensayos para los dos tiempos de incubaciones.9-10

El número de células NK relacionado con el grado de citotoxicidad de un individuo no pudo obtenerse, ya que no se evaluó el número de células CD56+ y CD16+; pero los resultados de otros autores en este sentido son controvertidos y se puede encontrar niveles normales o bajos de NK en sujetos con actividad funcional normal o alta.11-14

Una disminución en la expresión del CD6 similar a la encontrada en este estudio fue reportada anteriormente en enfermos de cáncer de mama.15,16 La correlación que se obtuvo entre el aumento de las cifras del CD6 y el CD3 y el incremento en los valores de citotoxicidad a las 18 horas puede estar relacionada con el importante papel de estas dos moléculas en los mecanismos de activación de los linfocitos T.17,18 Proceso que ocurre previo a la secreción por esta célula de las citoquinas antes mencionadas.

En general se observa que la respuesta celular en los pacientes es en algunos aspectos distinta a la de los individuos sanos; las desviaciones producidas por los factores que influyen sobre las células (probablemente citoquinas) fueron más notables en los enfermos. El estudio e identificación de estos factores solubles en relación con la variación en la expresión de marcadores de superficie y la evaluación funcional de mecanismos inmunológicos, revisten gran importancia para la comprensión de los fenómenos biológicos que ocurren en estos pacientes.

SUMMARY

The action of natural cytotoxic cells on a group of patients with colonic neoplasms before SW-948 and K-562 cellular lines was analyzed. Values of two different incubation times (4 and 18 hours) were obtained, whereas CD3, CD4, CD6, CD8 and HLA-DR membrane phenotypic markers were studied in lymphoid cells of peripheral blood. Results were compared to those of a control group. Only the group of patients showed a marked increase of the cytotoxic activity after 4-18 incubation hours for both cellular lines. At the same time, this group showed low levels of CD3+ and CD6+ lymphocites. A positive correlation between these two markers and the cytotoxic activity was found.

Key Words: COLONIC NEOPLASMS/immunology' CARCINOMA/immunology BLOOD DONORS.

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Recibido: 28 de marzo de 1996. Aprobado: 9 de mayo de 1996.

Dr. Tomás Miguel Díaz Román. Instituto de Oncología y Radiobiología. Calle 29 esq. E, Vedado, Ciudad de La Habana.

1 Especialista de I Grado en Inmunología. Departamento de Biología. Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología.
2 Licenciada en Matemáticas. Aspirante a Investigador. Departamento de Ensayos Clínicos. Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología.
3 Especialista de II Grado en Inmunología. Departamento de Biología. Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología.

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