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Rev Cubana Oncol 1997;13(1):17-22
Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología

Métodos de cuantificación de la actividad citotóxica natural: un estudio comparativo

Lic. Marta Elena Guerra Yi1 y Dr. Tomás Miguel Díaz Román2

RESUMEN

Las unidades líticas constituyen en la actualidad una de las formas más usadas de cuantificación de la actividad citotóxica natural. En el presente trabajo se utilizaron regresiones lineales y no lineales propuestas en la literatura para el cálculo de éstas, con el objetivo de comparar el comportamiento de dichos modelos. Fueron ajustadas ecuaciones de regresión lineal de: a) por ciento de cromo desprendido vs la cantidad de células electoras, b) por ciento de cromo desprendido vs el logaritmo de la cantidad de células efectoras y (c) arcoseno de la raíz cuadrada de la proporción de cromo desprendido vs la cantidad de células efectoras; así como una ecuación no lineal de la forma Y=A*[1-exp(-k*x)], donde Y es el % de Cr desprendido. A la lisis máxima experimental, x la proporción efectorasdiana y k la pendiente de la recta que se obtiene al plotear In(A-Y) vx x. Los modelos fueron comparados desde un punto de vista estadístico, se utilizaron indicadores de bondad de ajuste, prueba de significación de la regresión para las ecuaciones lineales y porcentajes de variación explicados por los modelos, así como desde un punto de vista biológico a partir de su adecuación al fenómeno en estudio. El modelo de regresión no lineal usado mostró ventajas apreciables en este sentido.

Descriptores DeCS: CELULAS KISSER NATURALES/inmunología; CELULAS KISSER NATURALES/metabolismo. NEOPLASMAS/ metabolismo. NEOPLASMAS/inmunología. TESTS INMUNOLOGICOS DE CITOTOXICIDAD/método.

INTRODUCCIÓN

La evaluación de las células citotóxicas naturales en ensayos que prueban la capacidad lítica de éstas contra células dianas marcadas con radioisótopos, se ha convertido en un método de uso muy frecuente en los últimos años. En dichos experimentos se enfrentan diferentes cantidades de células asesinas naturales (NK), contra una cantidad fija de células dianas, para obtener finalmente porcentajes de citotoxicidad por cada proporción utilizada.

Existen varias formas de expresión de los resultados de la actividad lítica: (a) se emplea la representación gráfica de los por cientos de cromo desprendidos por un número fijo de células diana contra el número de linfocitos adicionados. Esta resulta poco práctica cuando lo que se persigue es hacer comparaciones entre un gran número de individuos; (b) la utilización del por ciento de cromo desprendido en una sola proporción de células efectoras-diana (E:D), la cual generalmente no produce una estimación cuantitativa adecuada de esta actividad, pues, por una parte se pierde información al desechar datos generados por el experimento, y por otra se llega a conclusiones diferentes en dependencia de la proporción E:D utilizada; (c) a través de la unidad lítica (UL), que se define como la cantidad de células efectoras requeridas para producir la lisis de un por ciento determinado de células dianas y que generalmente se expresa como UL/106 células efectoras.1 Este concepto, que fue concebido para proporcionar una expresión numérica de la actividad citotóxica independiente de la selección arbitraria de una proporción E:D, es utilizado en la actualidad por muchos autores para reportar sus resultados.2-8

El cálculo de las UL puede realizarse del ajuste de una curva a los datos que se derivan del experimento, para esto existen dos enfoques que se refieren a los métodos de mínimos cuadrados lineal y no lineal, y que en el caso del primero incluye diversas transformaciones de los datos; así se tienen el ajuste de regresiones lineales de: (a) por ciento de cromo desprendido vs la cantidad de células efectoras, (b) por ciento de cromo desprendido vs el logaritmo de la cantidad de células efectoras y (c) arcoseno de la raíz cuadrada de la proporción de cromo desprendido vs la cantidad de células efectoras, así como el ajuste mínimo cuadrático no lineal de una ecuación exponencial.9,10

En el presente trabajo se estudió la actividad NK en ocho individuos supuestamente sanos y los resultados obtenidos fueron analizados por las cuatro variantes arriba expuestas para el cálculo de las UL, con el objetivo de describir el comportamiento de los modelos propuestos.

MÉTODOS

Actividad NK

Se realizó un ensayo de citotoxicidad de las células NK según el esquema habitualmente usado.11 Se empleó como células diana la línea SW-948, las cuales se marcaron con Cr 51 (Cromato de Sodio 51, Solución PB. Amersham, UK) y se enfrentaron a células mononucleares periféricas obtenidas a partir de 15 mL de sangre heparinizada; fueron separadas por centrifugación sobre gradiente de densidad a 1,077 g/mL según Boyún12 en las proporciones 40:1; 20:1; 10:1; 5:1 dispensados a volumen final 200 ml/pozo durante 4 horas a 37oC y CO2 5 % en aire. Se colectaron los sobrenadantes y se midió la radiactividad en contadores de radiaciones. (LKB, Sweden).

Los por cientos de citotoxicidad se obtuvieron según la fórmula: % = (Lm - Le) / (Lt - Le)*100, donde Lm es la media de los conteos por minuto (cpm) de las muestras, Le la media de los cpm de la lisis espontánea, Lt la media de los cpm de la lisis total obtenida por destrucción celular con detergente Triton 5 %.

Procesamiento de los datos

Se ajustaron los tres modelos de regresión lineal señalados anteriormente a los datos obtenidos para cada individuo, así como un modelo de regresión no lineal dado por una ecuación exponencial de la forma Y=A*[1-exp(-k*x], donde Y es el % de Cr desprendido, A la lisis máxima experimental, x la proporción efectoras-diana y k la pendiente de la recta que se obtiene al plotear In(A-Y) vx x.1 Los parámetros de estas ecuaciones se estimaron a través de los métodos de mínimos cuadrados lineal y no lineal que aparecen en el paquete estadístico SAS, ver 6 Cary, NC: SAS Institute Inc; 1986.13,14

Las unidades líticas fueron calculadas al 10, 20 y 30 % para cada uno de los ocho individuos y a partir de cada modelo empleado. En calidad de indicadores del comportamiento de los modelos se utilizaron: la prueba de significación de la regresión (en el caso de las ecuaciones lineales), los porcentajes de variación explicados por los modelos (expresados por el coeficiente de determinación R2) y los valores de citotoxicidad relativa obtenidos a partir de éstos. Estos últimos se calcularon dividiendo entre sí las unidades líticas correspondientes a los dos individuos cuya actividad se comparó.1

RESULTADOS

En la tabla 1 se muestran los valores de UL al 30 % de cada donante, que fueron calculados por los distintos modelos, así como los coeficientes de determinación R2 obtenidos para cada ecuación y los resultados de la prueba de significación de las regresiones lineales.

TABLA 1. Valores de UL al 30 % de R2 para cada modelo; significación estadística de los modelos lineales (p)

Individuos 
% Cr vs cantidad de efectoras
% Cr vs logaritmo de cantidad de efectoras
Arcoseno de raiz de % Cr vs de cantidad efectoras 
Modelo exponencial
(Modelo 1)
(Modelo 2)
(Modelo 3)
(Modelo 4)
No. 
UL
R2
p
UL
R2
p
UL
R2
p
UL
R2
1
0,63
0,88
*
0,003
0,99
**
1,17
0,74
ns
0,37
0,96
2
10,57
0,73
ns
11,34
0,93
*
9,84
0,71
ns
12,79
0,99
3
2,64
0,99
**
2,26
0,92
*
2,66
0,98
ns
2,34
0,99
4
2,47
0,95
*
2,13
0,98
**
2,52
0,88
ns
2,18
0,99
5
2,91
0,85
ns
3,05
0,98
**
2,92
0,79
ns
2,90
0,98
6
1,72
0,93
*
0,74
0,93
*
1,88
0,88
*
1,57
0,97
7
0,31
0,75
ns
0,00001
0,94
*
0,59
0,69
ns
0,25
0,91
8
2,21
0,88
ns
1,73
0,97
**
2,29
0,83
ns
2,82
0,96
(*) p<=0,05
(**) p<=0,01
Ns: valor de p no significativo

Considerando los valores de R2 se observó que el modelo exponencial tiene buen comportamiento; en un 88 % de los casos este modelo explica más del 95 % de la variación total, mientras que las regresiones lineales empleadas (modelos 1, 2 y 3) lo hacen en un 25, 50 y 13 % de los casos respectivamente. En lo referido a la prueba de significación de los modelos lineales, se tiene que la regresión lineal simple del por ciento de cromo vs el logaritmo de la cantidad de linfocitos mostró los mejores resultados.

En la tabla 2 se muestran los cocientes de los valores de UL calculados al 10, 20 y 30 %; en el primer caso se tienen los dos donantes que se encontraban en los extremos de mayor y menor citotoxicidad de todo el experimento (individuos 1 y 2) y que se corresponden con el tipo de datos con los cuales se tienen las mayores dificultades en el análisis. En ellos no fue posible el cálculo de las UL con los modelos 1 y 3; con el modelo 2 la selección de un por ciento de UL del 10, 20 ó 30 % da como resultado conclusiones diferentes en cuanto a la actividad citotóxica relativa de los donantes; esto no ocurre cuando se emplea el ajuste exponencial con el cual se obtienen valores relativos de citotoxicidad similares, de modo que la relación entre las UL de dos individuos se mantiene independientemente del por ciento escogido.

TABLA 2. Valores de citoxicidad relativa según modelo empleado
Cociente de UL entre individuos Porcentaje 
Modelo 1
Modelo 2
Modelo 3
Modelo 4
  10 %
ND
0,0061
ND
0,0289
UL1/UL2
20 %
ND
0,0013
ND
0,0290
  30 %
0,059
0,00029
0,11
0,0289
  10 %
0,157
0,088
0,23
0,1276
UL1/UL5
20 %
0,202
0,0098
0,35
0,1279
  30 %
0,216
0,001
0,40
0,1275
ND: No definido

En el segundo caso se relacionan los donantes de más baja y más alta citotoxicidad para los que sí fue posible el cálculo de las UL a través de todas las ecuaciones propuestas. Con el modelo exponencial nuevamente se obtuvieron los valores de citotoxicidad relativa de menor variabilidad.

DISCUSIÓN

Formalmente el modelo exponencial está más cerca del fenómeno biológico en estudio, puesto que no expresa un crecimiento indefinido de la citotoxicidad, además con su empleo se evita el riesgo de extrapolación en el cálculo de unidades líticas a por cientos que no caen en el rango de los valores experimentales alcanzados, error que con frecuencia se comete cuando se adopta un modelo lineal. De este modo, el empleo de los modelos lineales con estos fines resulta satisfactorio cuando se trabaja en un rango de proporciones en el que verdaderamente se cumpla la hipótesis de linealidad y no se precise de una posterior extrapolación.

Otro aspecto importante a tener en cuenta es el hecho de que si los valores de UL de dos individuos cumplen determinada relación de proporcionalidad, ésta debe mantenerse independientemente del por ciento que se prefije para el cálculo de éstas; de no ocurrir así, podrían obtenerse conclusiones diferentes de esta actividad en dependencia del por ciento escogido. Esta dificultad no se tiene con la ecuación exponencial, que en este sentido también mostró ventajas apreciables sobre el resto de los modelos.

De manera general se considera recomendable su uso para el cálculo de las unidades líticas.

SUMMARY

The expression of the CD6 molecule in peripheral mononuclear cells and axillary lymph nodes of 30 patients presenting with breast cancer without previous oncospecific treatment was studied by indirect immunofluorescence and immunohistochemistry, respectively. The monoclonal antibody (AcMO IOR-CD6) was used for the study. Results obtained in mononuclear cells showed a statistically significant reduction (P 0.01) of CD6+ cells in patients related to controls. These variations were more evident in advanced stages. In the study of the lymph nodes, the most significant result was an increase of the percentage of cases presenting with a low expression of CD6+ cells and the correlation (P 0.01) between levels of CD6+ cells in peripheral blood and lymph nodes.

Subject headings: BREAST NEOPLASMS/ultrastructure. LYMPHOCYTES/pathology. GANGLION/pathology. GLYCOPROTEINS/isolation & purification. GLYCOPROTEINS/deficiency.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Recibido: 21 de mayo de 1996. Aprobado: 9 de septiembre de 1996.

Lic. Marta Elena Guerra. Instituto de Oncología y Radiobiología. Calle 29 esq E, Vedado, Ciudad de La Habana.

1 Licenciada en Matemáticas. Sección de Investigaciones Clínicas.
2 Especialista de I Grado en Inmunología. Laboratorio de Inmunología Clínica.

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