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Rev Cubana Oncol 1999;15(1):30-5
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Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología
 

Efecto producido sobre la actividad antitumoral del Coralán por el tratamiento con una enzima proteolítica

Lic. Rita M. Pérez Gil,1 Lic. Ana D. Ávila Cabrera,2 Lic. José L. Bello Gárciga,3 Dr. Mario Cruz Nurque,4 Lic. Carlos F. Calderón Marín5 y Lic. Marta Montalvo Duquesne6
 

Resumen

Los biopolímeros obtenidos de fuentes naturales se han ganado un lugar entre los inmunoestimulantes de interés oncológico, en particular, los polisacáridos extraídos de algas y otros organismos marinos, pueden ser considerados como posibles nuevos medicamentos antitumorales. En el Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología, a lo largo de varios años se han desarrollado investigaciones encaminadas a caracterizar la actividad antitumoral del Coralán, biopolímero obtenido de un coral blando del mar Caribe. En el presente trabajo se demuestra que el tratamiento de la molécula de Coralán con una enzima proteolítica produce una reducción en el contenido de proteínas que conduce a la disminución de su actividad antitumoral.

Descriptores DeCS: CARCINOMA DE EHRLICH; PEPTIDO HIDROLASAS/farmacología; CNIDARIA/efecto de drogas; AGENTES ANTINEOPLASICOS.
 

En las últimas décadas, han sido evaluados numerosos productos capaces de actuar sobre las células tumorales por medio de la estimulación de los mecanismos de defensa del organismo.1,2

Dentro de este tipo de moléculas se encuentra el coralán, biopolímero aislado de un coral blando que se encuentra en las aguas del Mar Caribe, con el cual se han desarrollado investigaciones encaminadas a caracterizar su utilidad como posible medicamento para el tratamiento de los pacientes con cáncer.

El coralán está constituido por polisacáridos y proteínas. El componente polisacarídico contiene arabinosa, galactosa, fucosa y glucosa, además de un ácido urónico no identificado; también contiene hexosaminas y presenta grupos sulfatos.3 Dado su alto peso molecular, hasta el momento, no ha sido posible fraccionar este compuesto en cromatografía de filtración en gel.

El coralán inhibe en un 50 %, el crecimiento tumoral de los tumores experimentales como el adenocarcinoma 755, el carcinoma pulmonar de Lewis y el sarcoma 180, cuando se suministra a las 48 horas después de transplantados los tumores en ratones BDF1.4

El coralán induce el rechazo del crecimiento del tumor ascítico de Ehrlich cuando se administra, en una dosis única de 50 mg/kg, 48 h antes del trasplante del tumor a ratones IBF1, al encontrarse que el 70 % de los animales inoculados no desarrolló el tumor después de 30 días de observación.5

El coralán estimula la actividad citostática de los macrófagos, la actividad de las células NK e incrementa la respuesta mitogénica de la fitohemaglutinina (PHA); también evita la metastización hepática y pulmonar producida por el melanona B16F10 trasplantado en ratones C57BL/6,6-9 donde pueda existir una relación entre su acción sobre los mecanismos de defensa del organismo y la actividad antitumoral, tal y como se reporta para otros inmunoduladores.10,11

Nuestro trabajo tuvo como objetivo conocer el efecto que produce sobre la actividad antitumoral del coralán, el tratamiento con una enzima proteolítica, con respecto al coralán sin tratar, al evaluar el aumento de la resistencia al crecimiento del tumor ascítico de Ehrlich en ratones IBF1 y al usar un esquema de tratamiento similar al utilizado por JL Bello y otros.5
 

Métodos

El coralán utilizado para este estudio fue obtenido en nuestro laboratorio a partir del coral Pseudoterogorgia americana, se siguió el método propuesto por Ovodova y otros en 1981 (certificado de autor SU 1098551) seguido de filtraciones en filtros bacteriológicos de 0,45 µm y 0,2 µm.
 
Determinación de los contenidos de carbohidratos y proteínas
El contenido de carbohidratos y proteínas se determinó por los métodos de Dubois12 y Lowry13, respectivamente.
 
Fraccionamiento cromatográfico del coralán en una matriz de intercambio iónico
A una muestra que contenía 12 mg de coralán disuelta en tampón Tris-HC1 0,01 M pH 6,0 a una concentración de 2 mg/L, se aplicó en una columna, con una matriz DEAE-Sephacel, de volumen de 2 mL. Se utilizó como tampón inicial Tris-HC1 0,01 M pH 6,0. Las sustancias retenidas en la matriz se despegaron utilizando un gradiente salino desde 0,01M hasta 3M de NaCl. La velocidad de flujo utilizada fue de 5 mL/h y se colectaron fracciones con un volumen de 0,5 mL.

Se obtuvo el perfil cromatográfico de proteínas al medir la intensidad óptica en cada fracción cromatográfica (280 nm) y se realizó la determinación del contenido de carbohidratos en cada fracción por el método de Dubois midiendo la densidad óptica a la longitud de onda 495 nm.
 

Tratamiento del coralán con una enzima proteolítica (Pronasa)
El tratamiento con pronasa se realizó disolviendo 250 mg de coralán en 50 mL de tampón Tris-HC1 50 mM, CaCL2 10 mM pH 7,9 y se añaden 50 mg de la enzima. El tiempo de incubación fue de 48 horas a una temperatura de 37°C. Después se hirvió la mezcla durante 5 minutos y se separó por diálisis contra agua destilada. El producto dializado se llevó a sequedad por liofilización.
 
Comparación del fraccionamiento cromatográfico del Coralán tratado con pronasa y sin tratar
Dos muestras que contenían 60 mg de coralán tratado y sin tratar se disolvieron en el tampón inicial hasta una concentración de 1 mg/mL. Se aplicaron en una columna de matriz de DEAE-Sephacel de volumen de 75 mL. El tampón inicial fue Tris-HC1 0,01M pH 6,0 y se despegaron, las sustancias retenidas en la matriz, con un gradiente salino, utilizado desde 0,01M hasta 3M de NaCl. La velocidad de flujo fue 10 mL/h y se colectó un volumen de 5 mL por cada fracción.

Se obtuvo el perfil cromatográfico de proteínas midiendo la densidad óptica (250 nm) en cada una de las fracciones colectadas.
 

Evaluación biológica
Dos grupos de ratones IBDF1 (IOR/Hav x C57BL/6Ha) fueron tratados con coralán tratado con pronasa y sin tratar, en dosis de 20 mg/kg, durante 5 días. Transcurridas 48 horas después de finalizado el tratamiento, se realizó el trasplante del tumor ascítico de Ehrlich, a razón de 2 x 106 células por animal. El grupo control consistió en ratones trasplantados con el tumor tratados con solución salina fisiológica.

Los animales se observaron diariamente y a los 30 días de inoculado el tumor, y se determinó el porcentaje de animales positivos, aquellos donde el tumor prendió y el porcentaje de animales negativos, donde no hubo prendimiento del tumor de Ehrlich.
 

Resultados

El coralán obtenido presentó un 15 % de proteínas y un 55 % de carbohidratos, determinados por los métodos de Lowry y Dubois, respectivamente.

Al fraccionar el coralán en la matriz de DEAE-Sephacel y obtener los perfiles cromatográficos de proteínas y carbohi-dratos se observa (fig. 1), que el coralán está compuesto principalmente por carbohidratos y proteínas que eluyen con el tampón de aplicación, aunque también están presentes carbohidratos que eluyen a diferente molaridad de NaCl, al aplicar el gradiente salino. Este resultado confirma la presencia de polisacáridos cargados en la molécula de este biopolímero, dado por la presencia de grupos sulfatos y ácidos urónicos.3
 

Figura 1
Fig.1. Perfil cromatográfico del Coralán obtenido de una columna de matriz de DEAE-Sephacel.
 
El tratamiento del coralán con la enzima proteolítica, produce una disminución en el máximo correspondiente al perfil de proteínas (D.O. 280 nm) con respecto al del coralán sin tratar (fig. 2). Este resultado coincide con la determinación del contenido de proteínas por el método de Lowry donde se observa una disminución, de 0,15 mg/mL, en el coralán sin tratar, a un 0,12 mg/mL para el tratado con la enzima, lo que representa una reducción del 20 %.
 
Figura 2
Fig.2. Perfil cromatográfico del Coralán antes y después del tratamiento
con pronasa obtenido de una matriz de DEAE-Sephacel.
 
En los ensayos de evaluación de la actividad antitumoral (tabla) se observa que en el grupo de animales que recibieron el coralán tratado con pronasa, disminuye el porcentaje de los que rechazan el tumor (50 %), con respecto a los que recibieron el coralán nativo (sin tratamiento con la enzima) donde el porcentaje de los animales en que rechazó el tumor fue 87,5 %.
 
Tabla. Efecto sobre el prendimiento del tumor ascítico de Erhlich en ratones IBF1 después
del tratamiento con Carolán natural y Coralán tratado con pronasa
Grupo 
Producto
Dosis 
(mg/kg)
Positivos 
(%)
Negativos 
(%)
1
Tratado con pronasa
20
50
50
2
No tratado
20
12,5
87,5
3
Control
NaCL 15 mM
90
10

 

Discusión

De los resultados obtenidos, podemos señalar que en las condiciones en que se realizó el tratamiento con pronasa se produce la pérdida del contenido de proteínas presentes en la molécula de coralán (20 %), esto puede ser atribuido a la complejidad estructural de la molécula lo cual no permite una total interacción con la enzima.

Aunque aparentemente pequeña la cantidad de proteína afectada por el tratamiento con pronasa, el daño es suficiente para disminuir la actividad antitumoral del coralán lo que permite inferir que la parte protéica de esta molécula tiene un papel importante para que manifieste su actividad biológica.
 

Summary

The biopolymers obtained from natural sources have occupied an important place among the immunostimulants of oncological interest, particularly, the polysaccharides extracted from sea plants and other marine organisms that may be considered as possible new antitumor drugs. At the Institute of Oncology and Radiobiology, research has been carried out for many years in order to characterize the antitumor activity of Coralán, a biopolymer obtained from a soft coral from the Caribbean Sea. In the present paper it is shown that the treatment using the molecule of Coralán with a protolytic enzime produces a reduction in the content of proteins that leads to the decrease of its antitumor activity.

Subject headings: CARCINOMA, EHRLICH TUMOR; PEPTIDE HYDROLASES/pharmacology; CNIDARIA/drug effects; ANTINEOPLASTIC AGENTS.
 

Referencias bibliográficas

  1. Philip PA, Rea D, Thavasu P. Phase I Study Bryostatin I: assessment of interleukin 6 and tumor necrosis factor alpha induction in vivo J Nat Cancer Inst 1993;85:1812-8.
  2. Cragg G, Newman DJ, Raymond BW. Coral reefs, forest and termal vents: the worldwide exploration of nature for novel antitumor agents. Semin Oncol 1997;24:156-63.
  3. Molchanova V, Ovodova R, Ovodov Y, Elkin YN, Fernández V. Studies of polysaccharide molety of Coralán. A glycoprotein from Pseudoterogorgia americana. Carbohydr Res 1985;141:289-93.
  4. Bello JL, Mainardi V, Ovodova R, Valiente O, Sanfiz JM, Torres F. Estudio del Coralán. Actividad antitumoral directa. Rev Cubana Oncol 1991;7:30-3.
  5. _____. Estudio del Coralán. Actividad antitumoral indirecta. Rev Cubana Oncol 1991;7:34-7.
  6. Pereda CM, Gogel AF, Ríos M, Doupon MF, Bello JL. Actividad biológica de biopolímeros de orígen marino. Influencia sobre la actividad de los macrófagos provenientes de ratón. Rev Cubana Oncol 1990;6:270-1.
  7. Pereda CM, Gogel AF, Ríos M, Doupon MF, Bello JL. Actividad biológica de biopolímeros de origen marino. Influencia sobre la actividad asesina natural NK en el ratón. Rev Cubana Oncol 1990;6:265-9.
  8. Pereda CM, Alvarez A, Lascaux V, Poupon MF, Bello JL. actividad biológica de biopolímeros de origen marino. Influencia sobre la metastización pulmonar. Rev Cubana Oncol 1990;6:275-80.
  9. Ríos M, Fernández LE, Bello JL, Domínguez LD. Comportamiento de la respuesta a la fitohemaglutinina (PHA) de linfocitos humanos en presencia de Coralán. Rev Cubana Oncol 1993;9:7-20.
  10. Ríos M, Bello JL. Immunopharmacological studies of b 1-3 glucan. Arch Med Res 1994;25:179-80.
  11. Itoh H. Antitumor activity and immunological properties of marine algae polysaccharides. Anticancer Res 1993;13:2045-52.
  12. Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem 1951;193:265.
  13. Dubois M, Gilles K, Hamilton JK, Robers PA, Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal Chem 1956;28:350-6.

  14.  
Recibido: 15 de octubre de 1998. Aprobado: 6 de noviembre de 1998.
Dra. Rita M. Pérez Gil. Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología. Calle 29 esquina a E, El Vedado, Ciudad de La Habana, Cuba.
 

1 Lic. en Química. Investigadora Auxiliar.
2 Lic. en Química. Investigadora Agregada.
3 Lic. en Biología. Doctor en Ciencias.
4 Dr. en Medicina Veterinaria. Aspirante a Investigador.
5 Lic. en Física Nuclear. Investigador Agregado.
6 Lic. en Veterinaria. Aspirante a Investigadora.
 
 

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