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Rev Cubana Oncol 1999;15(3):186-92
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Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología

Influencia de citocinas en respuesta citotóxica natural de pacientes con cáncer de mama

Dra. María del Carmen Arango Prado,1 Lic. Leticia Llánes Fernández,2 Dr. Luis Moreno de Miguel3 y Dra. María Elena Fáxas García4

RESUMEN

Se estudió la respuesta citotóxica natural en un grupo de 10 pacientes con cáncer de mama (5 pacientes de estadios IIa, 2 de estadios IIb y 3 de estadio IIIa). Para esto, las células mononucleares periféricas fueron estimuladas con citocinas (IFN g e IL-2) a 37 °C en atmósfera 5 % CO2 durante 72 horas, donde se evaluó la actividad citotóxica natural mediante marcaje isotópico con Cr 51. Se utilizó paralelamente un grupo de 12 controles en las que se obtuvo un incremento significativo de la actividad citotóxica de células activadas con citosinas. Los resultados en la mayoría de las pacientes de estadios IIa sugieren que el compromiso de la actividad citotóxica celular puede restablecerse con el IFN-g y la IL-2; sin embargo, en casi todas las pacientes de estadios avanzados se obtuvo una pobre respuesta citotóxica, la cual no se restablece al ser estimuladas con las citosinas empleadas; esto puede ser consecuencia de la existencia de factores supresores que comprometen la citotoxicidad y, por tanto, pueden afectar la respuesta inmune antitumoral, sobre todo en estadios avanzados.

Descriptores DeCS: NEOPLASMAS DE LA MAMA; CITOCINAS; LINFOCITOS T CITOTOXICOS; CITOTOXICIDAD INMUNOLOGICA; CELULAS KILLER NATURALES.

Existen evidencias que fundamentan la importancia de los mecanismos inmunes en la respuesta antitumoral humana. Estos mecanismos están representados fundamentalmente por los linfocitos T citotóxicos (CTL) específicos, con fenotipo generalmente CD8+ y por una población linfoide que media su acción citotóxica de modo inespecífico denominada células asesinas naturales- Natural Killer- (NK). Estas células representan el 5 % de los linfocitos, se distinguen morfológicamente por ser linfocitos granulares grandes (LGL) y tienen la propiedad de destruir células infectadas por virus, células alogénicas y células tumo-rales.1 Las NK son capaces de mediar su acción, sin activación previa ni restricción aparente del sistema mayor de histocompatibilidad (MHC), de forma diferente a como lo hacen los linfocitos T y B; por esta razón el nombre de asesina natural.2

Los mecanismos efectores de tipo citotóxicos empleados por esta células son de 2 tipos fundamentales: el mecanismo mediado por exocitosis de gránulos3 y el mecanismo de apoptosis basado en interacciones Fas/Fas-Li.4 Su diferenciación y función está controlada por una compleja red de citocinas, algunas pueden potenciar mecanismos citotóxicos, tal es el caso de la interleucina (IL) 2, el interferón gamma (IFN g ) y la IL-125. El cultivo de células mononucleares periféricas (CMP) con estas linfocinas (IL-2 fundamentalmente) puede generar una población de células con elevada capacidad citotóxica denominada células citotóxicas activadas con linfocinas- lymphokine activated killer-(LAK).6

En pacientes con cáncer de mama se ha descrito una inmunodeficiencia celular progresiva caracterizada por las alteraciones en las subpoblaciones de linfocitos T y en la expresión de marcadores de superficie,7 el compromiso de la actividad citotóxica de células NK y de las células LAK,8 la depresión de la actividad lítica de linfocitos citotóxicos ,9 la depresión de hipersensibilidad tipo IV,10 la depresión de la respuesta proliferativa de linfocitos T,11 y la disminución en la síntesis de IL-2.12 Estos defectos son más evidentes en estadios avanzados de la enfermedad y están asociados a una variedad de efectos inmunosupresores entre los que se encuentran: citocinas supresoras como IL-10, IL-4,13 el factor de crecimiento transformante ß (TGF ß) y el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF),14 así como prostaglandinas producidas por monocitos, P15 E-like peptide y otros factores supresores del suero.15

Por todo lo anteriormente discutido, se estudió el comportamiento de la actividad citotóxica natural en un grupo de pacientes con cáncer de mama de estadios (IIa, IIb y III); así como la influencia de citocinas (IL-2 e IFN-g ) en la potenciación de la actividad citotóxica natural de éstas.

MÉTODOS

Se seleccionaron 10 mujeres que ingresaron en el Servicio de Mastología del Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología (INOR) para tratamiento quirúrgico, éstas fueron clasificadas por estadios según criterios del pTNM.16

Los criterios de inclusión fueron los siguientes: pacientes entre los 30 y los 70 años, con confirmación anatomopatológica de tumor, sin tratamiento oncoespecífico previo y sin otra enfermedad crónica cardiorres-piratoria, séptica o endocrinometabólica de importancia. En el grupo control se incluyeron 12 donantes voluntarias, aparentemente sanas, con edades entre los 30 y los 70 años, sin patología benigna de la mama ni otra enfermedad crónica o infecciones agudas demostrables.

Procedimientos

Se realizó extracción de 20 mL de sangre de la vena cubital del lado contrario al proceso tumoral en condiciones estériles y utilizando heparina. Las CMP fueron obtenidas por centrifugación en gradiente de densidad 1,077 g/mL (Histopaque 1077 -Sigma-) según método de Böyum17 y ajustadas a 1 x 106 cel/mL. El volumen total de la suspensión celular de cada caso individual fue dividido en 3 partes y dispensado en los pozos de placas de cultivo de 24 pozos, a razón de 1 mL/pozo. La primera parte de la suspensión dispensada en las placas se completó con 1 mL/pozo de medio RPMI con 10 % de suero fetal (células no estimuladas); a la segunda parte de la suspensión se le añadió 1 mL/pozo del IFN- (CIGB, Habana, Cuba) a una concentración previamente definida de 500 Uds/mL (máxima actividad citotóxica), y a la tercera parte se le adicionó 1 mL/pozo de IL-2 (CIB,CIGB, Habana, Cuba) a una concentración de 50 Uds/mL previamente definida. Esta placa se cultivó durante 72 horas, a 37 C y atmósfera con 5 % de CO2 en aire. Al cabo de este tiempo, las células fueron recolectadas, lavadas, y analizadas su viabilidad, ajustándose finalmente a 4 x 106 cel/mL, para ser utilizadas en el ensayo de citotoxicidad. Para definir las concentraciones óptimas de citocinas, se cultivó, en las condiciones antes descritas, las CMP de los controles, con diferentes dosis de IFN-g (125, 250, 500, 750 Uds/mL) y con diferentes dosis de IL-2 (25, 50, 100, 150 Uds/mL).

El ensayo de citotoxicidad natural de células mononucleares mediante marcaje isotópico (actividad NK) se realizó según técnica habitual,18 las células anteriores (efectoras) fueron ajustadas a 4 x 106 células/mL de medio RPMI 1640 + 10 % suero fetal. Se utilizó como célula blanco la línea eritroleucémica K562 a la que se le anadió una solución de Cr 51 (cromato de sodio, solución PB, Amersham, UK) a razón de 100 mci/2x106 células, finalmente fueron ajustadas a una concentración de 104 células/pozo. Las células efectoras y diana se enfrentaron 4 horas a 37 °C en 5 % de CO2 en placas de 96 pozos en U; estableciéndose 4 relaciones efectorasdianas 40:1; 20:1; 10:1 y 5:1 en un volumen final de 200 mL/pozo. Se colectaron los sobrenadantes y se midió la radiactividad en contador de radiaciones gamma durante 1 minuto.

Se estableció un índice de citotoxicidad (IC) en % para cada relación CMP: diana, según la fórmula:

IC = (LE - LO)/ (LT - LO) x 100

donde: LE: valor promedio de los conteos correspondientes a las lisis experimentales, LO: valor promedio de los conteos correspondientes a las silis espontáneas y LT: valor promedio de los conteos correspondientes a las lisis totales obtenida por destrucción celular con detergente tritón 5 %. Posteriormente se calcularon los valores de unidades líticas (UL) a partir de los índices de citotoxicidad, éstas se definen como la cantidad de células efectoras que lisan un porcentaje de células dianas predefinido por el investigador (30 %) por cada 1 millón de células efectoras. Dada su complejidad se realizó el cálculo mediante sistema automatizado creado al efecto, en el Laboratorio de Inmunología Clínica del INOR.

RESULTADOS

Se definieron previamente en el grupo control, las dosis óptimas para potenciar me-canismos citotóxicos, siendo de 500 Ud/mL de IFN-g y 50 Ud/mL de IL-2. Los resultados en este grupo demostraron que las medias de las UL de células estimuladas con IFN g y con IL-2 respectivamente, fueron significativamente superiores (p < 0,0000) que las medias de las UL de células no estimuladas (figura 1). Se definieron con estos resultados de los controles 3 niveles de corte, dado por: media (X) de las UL-2 x desviación estándar (DE). Siendo para células no estimuladas con citocinas = 5,92, para células + IFN-g = 9,90 y para células + IL-2 = 8,84. Por debajo de estos niveles se consideran valores de UL disminuidas.

Figura1
Fig. 1. Citotoxidad natural no inducida e inducida por citocinas en el grupo control.

Las 10 pacientes estudiadas fueron clasificadas por estadios pTNM en: 5 pacientes de estadio IIa, 2 de estadio IIb y 3 de estadio IIIa. Se evidenciaron algunas diferencias entre las respuestas citotóxicas inducidas por linfocinas de las pacientes de estadios IIa (estadios menos avanzados) y las pacientes de estadios IIb y IIIa (estadios más avanzados) (tabla). Como se muestra en la figura 2 se observó un aumento de la actividad citotóxica inducida por linfocinas en la mayoría de las pacientes de estadio IIa (4 de un total de 5 pacientes). Sin embargo, los resultados que se obtuvieron en las 5 pacientes de estadios más avanzados (IIb y III) no fueron alentadores (figura 3), ya que en la mayoría de estas pacientes no aumentaron de modo importante la actividad citotóxica después de la estimulación con linfocinas.

Tabla. Resultados de la citotoxicidad no inducida e inducida por citocinas en pacientes

Pacientes   Resultados en UL  
No. 
Estadio
Cél No Estim
Cél Estim IFN
Cél Estim IL-2
1
IIa
3,83
9,32
12,40
2
IIa
0,19
1,13
0,69
3
IIa
7,50
10,92
9,57
4
IIa
8,62
12,02
11,45
5
IIa
7,56
8,72
8,90
6
IIb
0,38
1,42
1,67
7
IIb
6,48
11,20
10,60
8
IIIa
0,09
0,07
0,08
9
IIIa
2,20
3,77
2,52
10
IIIa
2,40
1,70
2,80

Figura2
Fig. 2. Citotoxidad natural en pacientes con cáncer de mama (estadio IIa).

Figura3

Fig. 3. Citotoxidad natural en pacientes con cáncer de mama (estadios IIb y IIIa).

DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos en el grupo control se corresponden con múltiples investigaciones y están bien fundamentados en la literatura. Como es conocido la actividad citotóxica inespecífica de las células NK y de otras CMP, puede ser potenciada por citocinas como el IFN-g , IL-2, IL-12. El término de células LAK surge precisamente como resultado de la estimulación in vitro con linfocinas, obteniéndose una población de células con incremento en la actividad citotóxica.8

En las pacientes de estadios menos avanzados puede inferirse que se mantiene la capacidad de sus células efectoras de responder ante la estimulación con citocinas. Incluso pudo evidenciarse en una paciente con UL disminuidas, un aumento importante de la actividad citotóxica cuando se estimularon sus células con citocinas. Estos resultados preliminares pueden sugerir, el uso de citocinas y posible terapia LAK como forma de inmunoterapia adoptiva, con la finalidad de una potenciación de mecanismos citotóxicos antitumorales en las pacientes de estadios menos avanzados.

Por otra parte en estadios más avanzados se evidenció una disminución de la actividad citotóxica natural y el no restablecimiento de dicha función con el uso de IFN g e IL-2. Esto puede explicarse parcialmente por factores inmunosupresores, dentro de los que las citocinas juegan un papel central. Entre ellas sobresalen la IL-4, IL-6, IL-10, TGF ß y VEGF. El TGF ß es una de las más potentes citocinas inmunosupresoras, entre sus principales efectos está la inhibición de la producción de la IL-12, la inhibición de la diferenciación de los CTL, reduciendo la respuesta T frente a tumores y virus. El VEGF, es una citocina producida por la mayoría de los tumores y se conoce que es un potente inhibidor de la diferenciación de progenitores CD34 a células dendríticas, lo que inhibe la respuesta antitumoral.14 La IL-4 producida por linfocitos TH2 inhibe la formación de IL1ß y TNF en células monocitos/ macrófagos, por lo que se opone a los efectos del IFN g , y secundariamente a las acciones de la IL-2 e IL-12 inhibiendo la respuesta citotóxica celular.1 La IL-10 es producida principalmente por monocitos/macrófagos, linfocitos TH2 y también por las células tumorales; ésta puede inhibir la síntesis de citocinas de las células TH1 (entre las que sobresalen el IFN -g y la IL-2), por tanto afecta la activación y diferenciación de las poblaciones de linfocitos T y de células NK.19 La inhibición del IFN g , causada por la IL-10, ocasiona una disminución de las citocinas IL1 ß, TNF e IL-12. Estos 3 mediadores potencian la actividad citotóxica de monocitos/macrófagos y de células NK. También la IL-10 puede actuar directamente sobre IL1ß, TNF e IL-12, causando una inhibición de su síntesis en los monocitos//macrófagos.20 Otra citocina que juega un importante papel en la resistencia a la inmunoterapia con citocinas es la IL-6, ésta puede interferir con la IL-2 por mecanismos poco precisos, activando localmente la cascada de producción de factores inmunosupresores como la IL-10, y la prostaglandina E2.14

Está demostrado que la depresión de la respuesta inmune celular en cáncer puede ser consecuencia de factores como prostaglandinas (PGE2), histaminas, epinefrina; los que al interactuar con sus receptores originan una activación de la adenilato ciclasa y el aumento de AMPc en células inmunocompetentes (monocitos/ /macrófagos; células NK y células TH). El incremento en el AMPc causa efectos supresores de la respuesta inmune por diversos mecanismos, entre los que se encuentran la inducción de la síntesis de IL-10, y la activación de proteínas kinasas A, la que inhibe la formación de IL-2 en células T, como consecuencia de lo cual disminuye IFN-g y se inhibe la inmunidad celular.20 La citotoxicidad de las NK disminuye con el aumento del AMPc debido a 2 causas fundamentales: la disminución de la habilidad de las NK para unirse a células blanco y la inhibición en la síntesis de citocinas inductoras de NK (IFN-g , IL-2, IL-12). Los inductores de AMPc pueden potencialmente inhibir actividad citotóxica, tal es el caso de prostaglandinas E2 (PGE2), la histamina y la epinefrina. Actualmente se conoce de la existencia de algunos de estos factores supresores en el cáncer de mama, por tanto, se sugiere que el compromiso de la actividad citotóxica de las pacientes analizadas puede ser consecuencia de la acción de uno o varios de estos factores.15 También se conoce que la liberación de productos intermediarios del oxígeno por células tumorales puede inducir apoptosis en células NK, y esto en ocasiones es más evidente en estadios avanzados de la enfermedad.10

Todos los factores analizados en mayor o menor grado pueden ser responsables del compromiso de la respuesta citotóxica. No obstante, estudios futuros serán necesarios para profundizar en el conocimiento de estos aspectos y como utilizarlos con fines inmunoterapéuticos.

SUMMARY

The natural cytotoxic response of a group of 10 patients with breast cancer (5 patients with stage IIa cancer, 2 with stage IIb cancer and 3 stage IIIa cancer) was analyzed. For this purpose, the peripheral mononuclear cells were stimulated using cytokines (IFNg and IL-2) at 37 °C in a 5 % CO2 environment for 72 hours where the natural cytotoxic activity was evaluated through Cr51 isotopic labelling. At the same time, 12 controls were used for which a significant increased cytotoxic activity of cytokine-activated cells was obtained. The results of the majority of patients with stage IIa cancer suggested that the cellular cytotoxic activity could be re-established by using IFNg and IL-2; however, almost all the patients suffering from advanced stage cancer showed a poor cytotoxic response which was not re-established when cells were stimulated by the aforementioned cytokines. This may be caused by existing suppressor factors that compromise cytotoxicity and therefore, can affect the anti-tumor inmune response mainly in advanced stage cancers.

Subject headings: BREAST NEOPLASMS; CYTOKINES; T-LYMPHOCYTES, CYTOTOXIC; CYTO-TOXICITY, IMMUNOLOGIC; KILLER CELLS, NATURAL.

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Recibido: 11 de marzo de 1999. Aprobado: 26 de mayo de 1999.
Dra. María del Carmen Arango Prado. Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología. Calle 29 esquina a E, El Vedado, Ciudad de La Habana, Cuba.
 
 

1 Especialista de I Grado en Inmunología Clínica.
2 Licenciada en Bioquímica. Investigadora Agregada.
3 Especialista de II Grado en Oncología. Profesor Titular.
4 Especialista de II Grado en Inmunología Clínica. Investigadora Titular.
 
 
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