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Rev Cubana Oncol 1999;15(3):193-8
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Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología

Evaluación química y biológica del ditiocarbamato 43gv040 durante sus estudios preclínicos. Estudios de estabilidad

Lic. Rosa Alba González Marquetti1 y Lic. José Luis Bello Gárciga2

RESUMEN

El ditiocarbamato 43GV040 presenta manifestaciones neurotóxicas cuando se administra en dosis letales a ratones, ratas y perros, por lo que se propuso hallar una evaluación biológica que indicara el comportamiento de esta toxicidad, así como disponer de una evaluación que corroborara la integridad del producto durante sus estudios preclínicos. En este estudio se demostró que existe una correspondencia entre las determinaciones biológicas y químicas propuestas; pudiéndose anunciar que tanto la materia prima como las formas farmacéuticas, se encuentran aptas en sus parámetros de calidad, cuando realizado el ensayo bajo las condiciones expuestas, el grado de neurotoxicidad se encuentra entre 40 y 50 transcurridos 45 min de la administración del producto. Se presentan datos sobre la estabilidad del producto almacenado en diferentes condiciones hasta el año de elaborado.

Descriptores DeCS: DITIOCARBA/toxicidad; DITIOCARBA/química; SELECCION DE MEDICAMENTOS; ESTABILIDAD DE MEDICAMENTOS.

Actualmente se profundiza en el estudio del Sodio-Dietilditiocarbamato (Imuthiol),1,2 como inhibidor de la enzima citocromo P 450; agente quelante del cobre, níquel, cadmio; eliminador de radicales libres e inmunomodulador (según aparece en el programa de los modificadores de las respuestas biológicas propuesto por Oldhan RK).3

Al ser ésta una droga con diversas actividades biológicas, sugiere múltiples usos clínicos, lo que está dado por su capacidad de prevenir el desarrollo de enfermedades de inmunodeficiencias inducidas por retrovirus,4,5 su actividad frente a las infecciones oportunistas que ocurren en el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA)6 y su capacidad inhibitoria de la activación de virus Epstein Barr (EBV)7 entre otras.

El Ditiocarbamato 43GV040 objeto de este estudio presenta actividad antineoplásica en algunos modelos experimentales, lo que unido a un amplio estudio preclínico toxicofarmacológico,8-10 le permitió su introducción a los ensayos clínicos de nuestra institución.

Este producto fue obtenido por procedimientos de síntesis química en la Universidad de La Habana (Facultad de Química, Departamento de Química Inorgánica, 1987). El producto seco es altamente estable, pero muy inestable en solución y frente a trazas de cobre y metales en general, por lo que requiere de una rápida y cuidadosa manipulación.

Al administrarse en dosis letales, este producto produjo en ratones, ratas y perros, manifestaciones de neurotoxicidad y es conocido que los carbamatos como agentes anticolinesterásicos10-12 en la intoxicación aguda, manifiestan sus efectos por medio de signos y síntomas muscarínicos y nicotínicos.13,14

Por todo lo anterior, se realizó un estudio sobre las valoraciones químicas (determinación de pureza) y biológicas (comportamiento de la neurotoxicidad) a cada lote de materia prima y formas farmacéuticas (FF) elaboradas a partir de éstas, así como la evaluación de su estabilidad hasta el año de preparados.

MÉTODOS

Se emplearon 6 animales albinos (línea IOR) por grupo, cuyos pesos oscilaban entre los 18 y los 22 g. Bajo un tratamiento único se les inoculó, por vía intraperitoneal, el Ditiocarbamato (800 mg/kg de peso del animal) disuelto en solución salina fisiológica y se estableció un grupo control, al cual, se le administró solamente solución salina fisiológica según el peso del animal.

La evaluación biológica consistió en observar la conducta de cada grupo de animales codificando los signos neurotóxicos por orden de aparición, asignándoles un valor que permitiera hacer medible el grado de neurotoxicidad (tabla).

Tabla. Signos neurotóxicos por orden de aparición. Puntuación

Signos     
Neurotóxicos 
Grados
Puntuación
Ptosis parpebral
I
10
Letargo    
Sueño    
Dificultad respiratoria    
Excitabilidad
II
20
Sobresalto    
Mordisqueo    
Salivación
III
30
Marcha atrás    
Convulsión    
Saltos
IV
40
Muerte
V
50
Normal
0
0

 

Se establecieron período de observación para los grupos tratados y el control a los 15, 30, 45 y 60 min de administrados los tratamientos. A los animales se les suministró la dieta normal de ratonina elaborada por el CENPALAB y agua ad libitum.

Para eliminar las variaciones cronobiológicas, las investigaciones fueron realizadas siempre a la misma hora.

Para las evaluaciones químicas15 se emplearon métodos espectrofotométricos cuantitativos a las longitudes de onda de 260 nm y 430 nm. Los equipos empleados fueron balanza analítica Sartorius, los espectrofotómetros UV/VIS Pye Unicam SP500 serie 2 Specord UV/VIS Carl Zciss Jena.

Las determinaciones de humedad de las muestras se realizaron con la Pistola de Fisher.

RESULTADOS

Se seleccionó la dosis de 800 mg/kg de peso (LD100) pues ésta evoca alta variedad de signos neurotóxicos y permite seguir el curso de los efectos durante una hora (fig.1).

Figura1
Fig. 1. Dosis dependencia del efecto neurotóxico del ditiocarbamato 43GV040 para diferentes dosis del mismo, expresadas como mg/kg de peso del animal. En la ordenada se muestra el grado neurotóxico y en la abscisa el tiempo de observación en minutos.

Se analizaron 14 lotes de materia prima (conc, 10 mg/mL) entre los cuales 12 presentaron en la determinación espectrofotométrica a 260 nm lecturas entre 0,49 y 0,55. Estos lotes mostraron grados de neurotoxicidad superiores a 40 puntos con dosis de 800 mg/kg de peso del animal.

Los 2 lotes restantes, bajo las mismas condiciones de ensayo, mostraron lecturas entre 0,35 y 0,42 y no alcanzaron 30 puntos en los grados de neurotoxicidad.

En otro experimento (fig.2a) se compararon, en un ensayo inicial (t=0) los grados de neurotoxicidad obtenidos con la materia prima del Ditiocarbamato y las FFs elaboradas de ésta y liofilizadas a partir de agua o de tampón fosfato pH 7,0. Se repitieron las determinaciones al mes (t=1 mes, fig. 2b) y tres meses (t=3 meses, fig. 2c) de confeccionada la FF.

Figura2
Fig. 2. Evaluación biológica del ditiocarbamato 43GV040 materia prima (rombos) y las FF liofilizadas en agua (cuadrados) y en buffer fosfato pH 7,0 recién preparado (triángulos) y tras un mes de su preparación (cruces).

Posteriormente se evaluaron 3 lotes de materia prima del Ditiocarbamato relacionando los resultados obtenidos para las materias primas recién preparadas, tras 1 mes y 6 meses de la obtención de éstas (fig. 3).

Figura3
Fig. 3. Evaluación biológica a diferentes lotes de materia prima del ditiocarbamato a diferentes tiempos luego de su preparación.

La fig. 4 muestra los resultados obtenidos en la evaluación biológica con la materia prima (L25) y la FF elaborada a partir de ésta, transcurrido 6 y 12 meses de su preparación y conservadas a diferentes temperaturas.

Figura4
Fig. 4. Evaluación biológica de la FF del ditiocarbamato en diferentes fechas tras su preparación con varias condiciones de almacenamiento.

La evaluación biológica de la FF almacenada por 12 meses se vuelve analizar con un mayor número de animales divididos en tres grupos (fig. 5).

Figura5
Fig. 5. Evaluación biológica de la FF a los 12 meses de preparada. Valores promedio de la neurotoxicidad observada en 3 grupos de animales.

En relación con la evaluación química, la FF del Ditiocarbamato elaborada a partir de la materia prima (L25) por el método espectrofotométrico en la región ultravioleta, inicialmente mostró un valor de 81 % (81 mg/bulbo) y transcurridos 6 meses de su elaboración un 89 % (89 mg/bulbo) y 84,6 % (84,6 mg/bulbo) al ser evaluado en la región visible.

Posteriormente se elaboró otra FF con un nuevo lote de materia prima que reportó en la región ultravioleta un 90,7 % (90,7 mg//bulbo) y en la región visible un 82,7 % (82,7 mg/bulbo).

En las primeras determinaciones químicas se compararon las lecturas espec-trofotométricas. Aquí se dan los resultados obtenidos aplicando el método químico ya estandarizado para la determinación de la pureza del producto (contenido en mg/bulbo); según (Rubio L. Propuesta de evaluación química y biológica a la forma farmacéutica de un carbamato de interés oncológico. Trabajo de diploma. UH. INOR:1987).

DISCUSIÓN

En el estudio realizado a 14 lotes de materia prima (conc. 10 mg/mL) se demuestra que existe correspondencia entre las evaluaciones químicas y biológicas aquí presentadas ya que cuando se produce una disminución en los máximos que este producto exhibe en la región ultravioleta del espectro, debido a una degradación del producto se corresponde con una pérdida de las manifestaciones neurotóxicas.

En las fig. 2A, 2B y 2C puede apreciarse que no hubo variaciones en el comportamiento de los efectos neurotóxicos en el tiempo al superponerse los valores para todas las muestras ensayadas, por lo que decidimos tomar esta evaluación para el estudio de estabilidad del Ditiocarbamato 43GV040.

En la fig. 3 el grupo control para cada una de las evaluaciones permaneció asintomático por lo que su curva coincide con el eje de las x. En ésta se puede observar que para los diferentes lotes, el grado de neurotoxicidad está entre 40 y 50 a partir de los 30 min de administrados los tratamientos y en el caso de los lotes 30 y 36, se conservan los mismos niveles de neurotoxicidad aún después de transcurridos los 6 meses de su primera evaluación.

Al comparar los resultados obtenidos con la materia prima (L25) y la FF elaborada a partir de ésta (fig. 4) se encontró que la FF se conserva inalterable en lo que respecta a su toxicidad hasta los 12 meses de elaborada, pues los animales manifestaron prácticamente los mismos niveles de toxicidad que al inicio. Además, se observa que ésta no es afectada por el almacenamiento ambiental al menos dentro de los primeros 6 meses de elaborada.

Los resultados obtenidos con la FF almacenada por 12 meses fueron reafirmados al utilizar un mayor número de animales. En este caso se observó que el grado de neurotoxicidad promedio entre los 3 grupos es superior a 40 después de transcurridos 45 min de inoculado el producto (fig. 5).

Por los resultados obtenidos tanto en las evaluaciones neurotóxicas de los diferentes lotes de materia prima, así como las determinaciones realizadas a la FF liofilizada del Ditiocarbamato en diferentes fechas, a partir de su preparación, se infiere que éstas se encuentran aptas en sus parámetros de calidad; cuando realizados los ensayos bajo las condiciones aquí expuestas el grado de neurotoxicidad se encuentra entre 40 y 50 transcurridos 45 min de la inoculación del producto, invariablemente como corresponde a todo parámetro fármaco cinético.

Con relación a la estabilidad de la FF liofilizada de este Ditiocarbamato se concluye que conserva sus características químicas durante los primeros 6 meses y respecto a la evaluación biológica ésta se ha conservado estable durante un año.

AGRADECIMIENTOS

Queremos agradecer al Dr. Juan Lence Anta (INOR) por su valiosa colaboración durante la escritura de este trabajo.

SUMMARY

Dithiocarbamate 436V040 presents neurotoxic manifestations when administered in deadly dosages to mouses, rats and dogs, thus a proposal was made to find out a biological evaluation indicating the behaviour of the toxicity and to avails of an evaluation for corroborating the integrity of the product during the pre-clinical studies. In this regard, it was shown that there was a correspondence between the proposed biological and chemical evaluations; therefore, it could be said that both the raw material and the pharmaceutical forms were suitable according to their quality parameters once the test was carried out under the said conditions, the level of neurotoxicity ranged from 40 to 50 forty-five minutes after the administration of the product. Data are provided on the stability of the stored product under different conditions up to one year from the date of production.

Subject headings: DITHIOCARB/toxicity; DITHIOCARB/chemistry; DRUG SCREENING; DRUG STABILITY.

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Recibido: 20 de mayo de 1999. Aprobado: 31 de mayo de 1999.
Lic. Rosa Alba González Marquetti. Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología. Calle 29 esquina a E, El Vedado, Ciudad de La Habana, Cuba.
 
 

1 Licenciada en Bioquímica Farmacéutica.
2 Doctor en Ciencias Biológicas. Investigador Titular.
 
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