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Rev Cubana Oncol 2000;16(1):35-9
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Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología

Aductos-ADN-Aflatoxina como biomarcadores de exposición en grupos de riesgo de cáncer de hígado

Dra. María T. Álvarez Bañuelos,1 Dra. Magda Carvajal Moreno,2 Dra. Nora Ruisánchez Peón3 y Dr. Francisco Rojo4

Resumen

La aflatoxina B1 está entre los más potentes carcinógenos conocidos. La presencia de esta toxina parece ser más frecuente en la orina de personas que han sufrido infecciones por el virus B de la hepatitis. En nuestro trabajo se estudió un grupo de 210 pacientes provenientes del Instituto de Nutrición "Salvador Zubirán" de México con diagnóstico de hepatitis B y C crónicas, cirrosis viral y alcohólica, y grupos controles. Las muestras de orina fueron procesadas y purificadas con columnas de afinidad y cuantificadas por ELISA y HPLC. Los resultados revelaron que el niel más alto de aflatoxinas obtenido correspondió a los grupos de riesgo de hepatitis B crónica (50 %) seguido por los de cirrosis (26 %) y por último el de hepatitis C (16,6 %). Estos resultados apoyan la validez de los aductos alfatoxina-ADN como un buen biomarcador de la expresión de este cancerígeno y su importancia en relación con las enfermedades hepáticas estudiadas.

Descriptores DeCS: ADUCTORES DE ADN/orina; AFLATOXINA B1/orina; HEPATOPATIAS/orina; NEOPLASMAS HEPATICOS/prevención y control.

La aflatoxina B1 (AFB1) está entre los más potentes carcinógenos conocidos para algunas especies animales y el hombre. La capacidad de la AFB1 para producir mutaciones se conoce por la habilidad de un metabolito activado para unirse covalentemente a la guanina del ADN en la posición N-7 (aducto) y esta reacción podría ser importante en el inicio del cáncer.1

Una serie de investigaciones epidemiológicas y de laboratorio han establecido una asociación entre hepatitis B crónica y el carcinoma hepatocelular.2-3 La relación entre estas 2 enfermedades ha sido argumentada por la presencia del ADN viral en células hepáticas tumorales, siendo 300 veces superior al riesgo de desarrollar un hepatocarcinoma por un portador crónico del virus de la hepatitis B que un no portador.4-5

Estudios epidemiológicos realizados en Asia y África han asociado la incidencia de cáncer primario del hígado con el consumo de alimentos contaminados con aflatoxinas.6,7

Aunque el cáncer hepático primario no está entre las primeras causas de muerte por cáncer a nivel mundial, no por eso tiene menos importancia que los que le preceden en este fatídico orden.8 Es sabido que esta neoplasia es muy agresiva y poco se logra para mejorar la sobrevida de estos pacientes con los métodos terapéuticos actuales. Por lo que se debe aprovechar todos los medios posibles para lograr una prevención efectiva. Lo que pudiera lograrse desarrollando técnicas dirigidas a la prevención de enfermedades que se sabe que son precursoras o predisponentes al cáncer hepático como las hepatitis y cirrosis.

Métodos

Selección y recolección de muestras.

Fueron seleccionados pacientes de la consulta de Gastroenterología del Instituto Nacional de Nutrición "Salvador Zubirán" de México con diagnóstico de hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV), cirrosis hepática de origen viral (CHV) y cirrosis hepática alcohólica (CHA), los que se corresponden con grupos de riesgo para cáncer de hígado primario (CHP) y como controles: enfermos con insuficiencia renal (IR), enfermedad crónica no hepática (ECNH) y además individuos aparentemente sanos. Se estudió un total de 210 individuos entre los grupos de riesgo y controles incluyendo los sanos, con 30 miembros cada grupo.

El estudio fue realizado con las orinas de 24 horas de los individuos seleccionados, las cuales se concentraron con cartuchos de Sep-pak, C-18 y purificaron en columnas monoclonales de antiaflatoxinas totales (Biocot).

Método de ELISA inhibitoria y de cromatografía de líquidos (HPLC)

Para cuantificar los aductos de AFB1-Gua se sintetizó los conjugados: de aflatoxina B1 con ADN de ternera (AFB1-ADN) y aflatoxina B1 con ovoalbúmina (AFB1-OVA). Se utilizó una columna deHPLC C-18 fase reversa (Pharmacia), para conocer su pureza y concentración. Después de purificados y validados, se utilizó en la técnica de ELISA inhibitoria para la detección de AFB1 libre, y el HPLC para cuantificar sus metabolitos (AFM1, AFP1) y las moléculas de aflatoxina B1 unida a los nucleótidos, principalmente su aducto guanina (AFB-N7- Gua) en orina humana.

Análisis estadístico

Se realizó el análisis de varianza y la prueba Kruskall-Wallis. Se hizo una comparación de grupos por contraste para conocer la relación existente con las enfermedades hepáticas y los grupos controles.

Resultados

Los casos positivos a AF detectados por ELISA de todos los grupos estudiados fueron: HBV (50 %) y HCV (16,6 %) crónicas; CHV (26 %); CHA (10 %); IR (3,3 %), ECNH (0 %) y sanos (10 %). El contenido de AF ((fig.) de las diferentes enfermedades se valoró mediante el logaritmo de la AF en un análisis de varianza y fue estadísticamente significativo (P < 0,0033).
Fig. Porcentaje de pacientes con orina positiva a aflatoxina en grupos de riesgos y controles.
Fig. Porcentaje de pacientes con orina positiva a aflatoxina en grupos de riesgos y controles.
 
Tabla. Resumen de la excreción de los diferentes tipos de aflatoxina y el aducto AFB-N7-Gua por HPLC y ELISA
Grupos
Casos AF positivos
AFB-N7-Gua
AFM1
Concentración ng/mL AFP1 
AFB1
HPLC ngAFmg/Cr
ELISA ngFmg/Cr*
Grupos de riesgo
HBV
50 %
1,0-38,8
1,7-80,3
18,2-32,1
152,6-292,2
1,1-530,6
0,1-1389,0
HCV
16,6 %
1,2-4,1
1,4-40,3
0
0
1,7-56,8
3,03-54,3
CHV
26,6 %
0,4-290,7
12,5-90,5
42,6-113,5
380,5-451,9
0,3-152,4
0,2-4106,2
CHA
10 %
0,9-1,7
0
0
0
0,3-2,6
1,25-8,5
Rango
10 50 %
0,4-290,7
1,4-90,5
18,2-113,5
152,6-451,9
0,3-152,4
0,12-4106,2
Grupos control              
IR
3,3 %
-
-
-
-
-
1,61
ECNH
0 %
-
-
-
-
-
-
Sano
10 %
1,38
1,1-3,7
2-2,8
0
1,4-8,6
6,9-33,6
 
Se puede observar en la tabla que existe una buena correspondencia lineal entre los 2 métodos utilizados: los datos obtenidos por HPLC para el total de los metabolitos oxidativos en la orina AFM1 y AFP1 y AFB1 y los aductos AFB-N7-Gua en orina, en comparación con los resultados obtenidos por ELISA que mostraron un coeficiente de correlación de 0,95 y un valor de r2 de 0,90. Sin embargo, la detección de AF por ELISA fue más sensible que la de HPLC.

Discusión

Al realizar la comparación entre los grupos de enfermos de origen viral (HBV, HCV y CHV) y el resto (CHA, IR, ECNH y S) la diferencia fue altamente significativa de P < 0,0002. De aquí se concluye que hay una coincidencia entre la presencia de los virus y de AF. Se obtuvieron resultados interesantes y significativos al comparar la presencia de aflatoxinas en los grupos de riesgo y controles en una población como la de México, en donde existe una alta incidencia de cirrosis, que no siempre esta asociada con alcoholismo y pudiera estar relacionada con la AF. Aunque la alimentación básica del mexicano es el maíz, también consume mucho arroz uno de los alimentos más susceptibles a la contaminación por esta micotoxina.9,10

La determinación AFB1 libre refleja exposiciones previas de 24 a 48 horas, en tanto los metabolitos AFM1 y AFP1 indican medidas de detoxificación metabólica. Cuando se complementan con la detección de aductos de ADN (AFB1-N7-Gua) en orina, muestran la exposición crónica y la tasa de recuperación del ADN de AF fijadas años atrás. La determinación de estos marcadores facilita grandemente las investigaciones en lo relacionado al papel que juegan las aflatoxinas en las enfermedades hepáticas virales.6-8 Estos resultados coinciden con los obtenidos por Groopman y colbs,6 lo que sugiere la importancia de las aflatoxinas como agente etiológico del cáncer hepático primario. Además el aducto AFB-N7-Gua en orina humana, puede ser buen biomarcador molecular del riesgo de daño por AF.5-10

El continuar realizando estudios complementarios con los aductos de ADN como un marcador de exposiciones crónicas, permitirá seleccionar en un futuro una cohorte en la que puedan repetirse las determinaciones de aflatoxina en orina en forma periódica y suministrar datos útiles acerca de la etiología de estas enfermedades.

Summary

Aflotoxin Bl is among the most potent known carcinogens. The presence of this toxine seems to be more frequent in the urine of persons that have suffered from hepatitis B virus infections. A group of 210 patients from the "Salvador Zubiran" Institute of Nutrition, in Mexico, with diagnosis of chronic hepatitis B and C, and viral and alcoholic cirrhosis was studied. Control groups were also included in the study. Urine samples were processed and purified with affinity columns and quantified by ELISA and HPLC. The results revealed that the highest level of aflotoxins obtained corresponded to groups at risk for chronic hepatitis B (50%) followed by those of cirrhosis (26 %) and, finally, by that of hepatitis C (l6.6 %). These results support the validity of the aflatoxin-DNA adducts as a good biomarker of the expression of this carcinogenic and its importance in relation to the studied liver diseases.

Subject headings: DNA ADDUCTS/urine; AFLOTOXIN Bl/urine; LIVER DISEASES/urine; LIVER NEOPLASMS/prevention and control. 

Referencias bibliográficas

  1. Wanag, Gropman JD. DNA damage by mycotoxins. Mutat Res 1999;424(1-2):167-81.
  2. Yu MW, Chiang YC, Lien JP, Chen CJ. Plasma antioxidant vitamins, chronic hepatitis B virus infection and urinary aflatoxin B1-DNA adducts in healthy males. Carcinogenesis 1997;18(6):1189-94.
  3. Sheu JC. Molecular mechanism of hepatocarcino-genesis. J Gastroenterol Hepatol 1997;12(9-10):5309-5313.
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  5. Otteneder M, Lutz WK. Correlation of DNA adduct levels with tumor incidence: carcinogenic potency of DNA adducts. Mutat Res 1999;8:424(1-2):237-47.
  6. Groopman JD, Jiaqi Z. Molecular dosimetry of urinary afta-toxin-DNA adducts in peoples living in Guangxi autonomous region, People's Republic of China. Cancer Res 1992;52:45-2.
  7. Vinitketkumnuen U, Chewonarin T, Kongtawelert P. Aflatoxin exposure is higher in vegetarians than nonvegetarians in Thailand. Nat Toxins 1997;5(4):168-71.
  8. MMWR. 1993 Deaths and hospitalizations from chronic liver disease and cirrhosis united States, 1980-1989. Morbility and Mortality Weekly Report 41(52):969-73.
  9. Alvarez MT, Carvajal M. Lisker-Melman M, Rojo R. Aflatoxin B1 in urine of humans with chronic B and hepatitis and cirrhosis in Mexico. Mycotoxins and Phycotoxins-developments in Chemestry, Toxicology and Food Safety 1998;21:181-85.
  10. Poitier MC. DNA adducts as exposure biomarkers and indicators of cancer risk. Environ health Perspect 1998;105(4 Suppl):907-12.
Recibido: 24 de septiembre de 1999. Aprobado: 28 de octubre de 1999.
María T. Álvarez Bañuelos. Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología. Calle 29 esquina a E, El Vedado, Ciudad de La Habana, Cuba. 
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