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Rev Cubana Oncol 2000;16(1):40-3
 
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Hospital Oncológico Docente "Conrado Benítez". Santiago de Cuba

Un método alternativo de coloración para extensiones de sangre periférica

Dra. María C. Céspedes Quevedo,1 Lic. Sarah Edward Seringe,2 Téc. Bárbara Centeno Pichardo3 y Téc. Lucrecia Alexis Richard4

Resumen

Se propone un método alternativo de coloración para sangre periférica que combina la eosina 0,1 % y el azul de metileno 0,1 %, ambos reactivos elaborados en la Empresa de Productos Biológicos "Carlos J. Finlay", permitió el ahorro de giemsa en momentos de gran escasez. Se demostró la identificación clara de los hematíes, plaquetas, polimorfonucleares neutrófilos y eosinófilos, y las células mononucleares en su conjunto, no así entre ellas. Se halló una buena precisión y exactitud en estos grupos de células en los recuentos diferenciales. Se plantea su utilidad para buscar predominio entre los leucocitos polimorfonucleares neutrófilos y los mononucleares (linfocitos y monocitos), para identificar eosinofilias, plaquetas, así como para evaluar el estado hematológico periférico en pacientes que reciben tratamiento con drogas citotóxicas, radiante o ambos.

Descriptores DeCS: COLORACION/métodos; EOSINA AMARILLENTA-(ys); AZUL DE METILENO; CELULAS SANGUINEAS.

Ante el necesario seguimiento hematológico de los enfermos con cáncer bajo tratamiento radiante o citotóxico,1 y dada la escasez del colorante giemsa fabricado por la Empresa de Productos Biológicos (EPB) "Carlos J. Finlay" y el alcohol metílico, utilizados para la coloración y fijación de las láminas de sangre periférica, respectivamente,2 se propuso idear un método de coloración que pudiera resolver total o parcialmente el problema creado, mediante el uso de otros colorantes elaborados por dicho centro para otros fines. Así, se recurre a la combinación de soluciones acuosas de eosina 0,1 % y azul de metileno 0,1 %, previa fijación de la lámina con una solución de alcohol etílico-formol 5 % 3, con el conocimiento previo de que con el precipitado que se forma al mezclar la eosina con el azul de metileno disuelto en alcohol metílico, se obtiene una solución que es fijadora y colorante al mismo tiempo.2

Es por ello que se plantea comprobar si los recuentos diferenciales leucocitarios, la observación de los hematíes y las plaquetas en los frotis teñidos con la coloración propuesta eran similares a los teñidos con giemsa.

Métodos

Se colorearon diferentes extensiones de sangre periférica con la coloración propuesta y se les entregó a 20 observadores, 8 de ellos de otros centros, los que fueron encuestados antes de utilizar las pruebas estadísticas para tener consenso sobre la identificación de las células. Se realizaron 32 extensiones triples de sangre periférica de diferentes pacientes que acudieron al laboratorio con indicación de hemogramas, una extensión se tiñó con la coloración propuesta y 2 con giemsa para aplicar la prueba de Fisher (precisión) y la de exactitud (diferencia entre medias). Esta última se realizó con la extensión periférica de un solo paciente, la que se repitió 10 veces con cada coloración.

Técnicas eosina-azul de metileno

  1. Fijar la lámina con solución alcohol-formol 5 % durante 1 minuto.
  2. teñir con eosina 0,1 %, 5 min. Lavar con agua corriente.
  3. Teñir con azul de metileno 0,1 %, 5 min. Lavar con agua corriente.
  4. Secar a temperatura ambiente.

Resultados

En la tabla 1 se demuestra que la coloración propuesta no define claramente las diferencias entre linfocitos y monocitos, lo cual no sucede así con el resto de las células que todos los observadores pudieron identificar; por ello las células mononucleares (linfocitos y monocitos) se agruparon al realizar los recuentos diferenciales. La precisión del método se expone en la tabla 2, donde existe la probabilidad de que el 95 % de las células identificadas por la coloración de prueba no sean diferentes a las observadas por el método de Giemsa.
Tabla 1. Resultados de la encuesta realizada a 20 observadores sobre la identificación de las células
 
Células
¿Se identifican con claridad?
No
Plaquetas
20
 
Hematíes
20
 
Polimorfonucleares neutrófilos
20
 
Polimorfonucleares eosinófilos
20
 
Linfocitos
11
9
Monocitos
11
9
 
Tabla 2. Precisión del método eosina-azul de metileno (Prueba de Fisher)
 
 
Neutrófilos
Células mononucleares
(linfocitos y monocitos)
Eosinófilos
N
R21
393
338
62
12
R22
1 112
1 346
281
32
SD1
4
14
1,6
 
SD2
4,1
21
2
 
Fisher (F)
1
2,25
1,5
 
F tabla = 2,57     P < 0,05
Leyenda:
N = Número de parejas en extensiones.
R1 = Diferencia individual (Giemsa).
R2 = Diferencia individual entre las dos coloraciones
SD1 = Desviación estándar (Giemsa).

En la tabla 3, los resultados de la prueba aplicada para señalar la exactitud del método propuesto (comparación de medias entre ambas coloraciones), muestran que no existen diferencias significativas entre los leucocitos observados por uno u otro.

Tabla 3. Exactitud del método eosina-azul de metileno. (Prueba de Lord)
Células
 
Neutrófilos
Mononucleares
Eosinófilos
X1
60,9
36,8
2,3
X2
62,8
35,6
1,6
Máx
69,0
43,0
5,0
Mín
54,0
29,0
0
Lord (L)
0,12
0,08
0,14
 
L tabla = 0,23            P < 0,05            N = 10
Leyenda:
 N = Número de veces realizado el recuento diferencial a la misma extensión de sangre.
X 1 Media (eosina-azul de metileno)
X 2 = Media (Giemsa).
máx = Valor máximo (eosina-azul de metileno).
Mín = Valor mínimo (eosina-azul de metileno).

Discusión

Al añadir el formol al alcohol para la solución fijadora, se garantiza la permanencia de la extensión de sangre sobre la lámina después del uso de 2 soluciones acuosas en la coloración. Al no poderse identificar las células mononucleares entre sí (pues la combinación de estos colorantes no dan detalles de gránulos ni inclusiones citoplasmáticas), en el recuento se agruparon los linfocitos y monocitos. Los eosinófilos absorben el color naranja en sus citoplasmas y los núcleos de los polimorfonucleares se tiñen de azul intenso, que contrasta con el azul pálido de sus citoplasmas, mientras que los hematíes y plaquetas se tiñen de otros matices de azul. Para identificar las células con esta combinación de colorantes se necesita una experiencia previa del observador en frotis teñidos con giemsa.

La precisión y exactitud obtenidas al comparar ambas coloraciones se consideran muy buenas, atendiendo a lo difícil que resulta medir las células adecuadamente en frotis sanguíneos, debido a la gran variación de las fracciones numéricas de las poblaciones celulares.4,5 El coeficiente de variación de neutrófilos y linfocitos puede superar el 25 % y el de eosinófilos y monocitos, hasta del 100 %.5

El efecto económico del método es bueno, pues no hay diferencia en el tiempo utilizado ni en el costo de la técnica en relación con la coloración en la que se utiliza giemsa.

Se concluye que con eosina-azul de metileno se pueden identificar los hematíes, plaquetas, polimorfonucleares neutrófilos, eosinófilos y células mononucleares, no así los linfocitos y monocitos entre sí ni las células inmaduras. La coloración propuesta resulta útil para conocer predominio de neutrófilos (sepsis), si hay eosinofilia, definir trombopenias y trombocitosis, así como para evaluar el estado hematológico en pacientes con tratamiento radiante o con drogas citotóxicas.

Se recomienda como método alternativo para el ahorro de giemsa, no como sustituto de éste.

Summary

An alternative staining method for peripheral blood that combines eosine 0.1 % and methylene blue 0.1 %, which are both prepared at the "Carlos J. Finlay" Enterprise of Biological Products, is proposed. This method allows the saving of Giemsa at a time of great shortage. It is proved the clear identification of erythrocytes, platelets, polymorphonuclear neutrophiles and eosinophiles, and of mononuclear cells as a whole, but not among them. Good precision and accuracy are found in these groups of cells during the differential recounts. Its usefulness to look for predominance between the polymorphonuclear neutrophil leucocytes and the mononuclear ones (lymphocytes and monocytes), to identify eosinophilias and platelets, as well as to evaluate the peripheral hematological status in patients receiving cytotoxic drugs or radiations, or both, is stressed.

Subject headings: STAINING-METHODS; EOSINE, YELLOWISH-(ys): METHYLENE BLUE; BLOOD CELLS.

Referencias bibliográficas

  1. Murphy GP, Lawrence JR, Lenhard RE. Rehabilitación del paciente con cáncer. En: Oncología clínica. Manual de la American Cancer Society. 2 ed. Washington, DC:OPS,1996:728.
  2. Wintrobe MM. Principios y técnica del examen de sangre. En: Hematología clínica. 3 ed. La Habana: Editorial Científico-Técnica, 1971:337-43.
  3. Forteza G. Atlas de citología sanguínea. Barcelona: Toray, 1963:36-40.
  4. Fischbach FT. Laboratory diagnostic test. Blood studies. 4 ed. Philadelphia: Lippincott 1992:25-6.
  5. Boquet Jiménez E, Castillo Sánchez ML, Cáceres de Maselli AL, Dybkaer R, Escutir V, Franzini C. Mejoría continua de la calidad. Fase analítica. México,DF:Editorial Médica Panamericana, 1995:73-80.
Recibido: 3 de septiembre de 1999. Aprobado:
Dra. María C. Céspedes Quevedo. Calle A. No. 153 entre Avenida de Céspedes y 4ta, Santiago de Cuba, Cuba.

1 Especialista de II Grado en Laboratorio Clínico. Profesora Asistente.
2 Licenciada en Química. Responsable de Control de la Calidad.
3 Técnico de Posbásico en Hematología.
4 Técnico en Laboratorio Clínico.

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