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Rev Cubana Oncol 2000;16(3):171-6
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Centro de Estudio de Biotecnología Industrial. Universidad de Oriente

Evidencias preliminares de la actividad inmunomoduladora de la fracción polisacárida de origen marino PC-1

Lic. Humberto J. Morris Quevedo,1 Lic. Clara E. Martínez Manrique,2 Lic. Roberto T. Abdala Díaz,3 y Lic. Guillermo Cobas Pupo4


RESUMEN

Se presentan los resultados preliminares obtenidos en la evaluación de las propiedades immunomoduladoras de la fracción polisacarídica PC-I, aislada a partir de cultivos en la fase estacionaria de la microalga Porphyridium cruentum, y administrada intraperitonealmente de forma repetitiva en dosis de 5, 25 y 50 µg a ratones de la línea Balb/c. El polisacárido en la dosis de 50 µg/raton incrementó de forma significativa (p<0,05) el número de células del exudado peritoneal donde se observa, además, cambios en su morfología. Los niveles de actividad de la enzima fosfatasa ácida lisosomal resultaron superiores en las 3 dosis ensayadas respecto al control (solución salina fisiológica), sugiriendo una posible estimulación de la actividad metabólica y funcional de las células del sistema fagocitario. Por otra parte, no se detectaron granulomas ni otras alteraciones macroscópicas en los sitios de inoculación y en las dosis de 5 y 50 µg/ratón se observó un ligero incremento de la masa esplénica.

Descriptores DeCS: ALGAS/aislamiento de purificación; POLISACARIDOS; MACROFAGOS PERITONEALES; ADYUVANTES INMUNOLOGICOS; RATONES CONSANGUINEOS BALB C.
 

Las propiedades inmunomoduladoras y antitumorales han sido demostradas en numerosos polisacáridos naturales aislados de hongos, levaduras, algas, bacterias, plantas superiores, así como en algunos derivados obtenidos por hidrólisis o modificación química.1,2

Los efectos promotores de la salud humana atribuidos a las algas se conocen desde tiempos inmemoriales debido a las antiguas experiencias en su uso por los aztecas y agrupaciones del África Central.3 Estas acciones positivas sobre el estado fisiológico general del organismo se han relacionado con la activación de los mecanismos de protección inmunitaria inherentes al mismo por sustancias naturales de elevado potencial terapéutico, resultando de una importancia especial los polisacáridos.4

En este sentido, las propiedades inmunorreguladoras de ciertos extractos de Chlorella están asociadas a su importante composición polisacárida5 y se ha demostrado, además, que la fracción polisacarídica intracelular de Spirulina platensis estimula la proliferación de los linfocitos T y las células NK, por lo cual podría resultar de gran interés en la investigación tumoral.4

En ensayos in vitro, al utilizar leucocitos mononucleados de sangre periférica humana, se ha evidenciado el efecto inductor de la síntesis de anticuerpos de 3 fracciones polisacarídicas de Porphyridium cruentum, sugiriendo una actividad moduladora sobre los linfocitos B. El mecanismo de dicha estimulación resulta aún desconocido.2

Al tomar en consideración las oportunidades biotecnológicas que ofrece la microalga Porphyridium cruentum como fuente valiosa de polisacáridos sulfatados, ha sido de interés estudiar en el presente trabajo el efecto in vivo de la fracción exocelular PC-I sobre los macrófagos peritoneales murinos y el peso de órganos del sistema fagocítico mononuclear como criterio preliminar de su actividad inmunopotenciadora.


MÉTODOS

Aislamiento y semipurificación de la fracción polisacarídica PC-I

La fracción fue obtenida por precipitación selectiva de los polisacáridos exocelulares presentes en el sobrenadante del cultivo en fase estacionaria de Porphyridium cruentum con bromuro de cetil piridinio (Cetavlón) al 2 %. El precipitado fue redisuelto con NaCl 4 M, y el polisacárido floculado nuevamente con etanol. Para su conservación la fracción fue secada en estufa a una temperatura de 80 °C.


Animales y esquema de administración del polisacárido

Se emplearon ratones Balb/c machos de 2 sem y un peso aproximado de 18 y 20 gr procedentes del Laboratorio de Anticuerpos y Biomodelos Experimentales (LABEX) de Santiago de Cuba, garantizándoles condiciones ambientales estables y un suministro de agua y alimento ad libitum. Las unidades experimentales que recibieron las diferentes dosis del polisacárido se conformaron a razón de 10 animales cada una.

El polisacárido disuelto en solución salina fisiológica se administró por la vía intraperitoneal los días, 0, 7, 14, 21 y 35 en dosis de 5 mg/ratón (grupo A), 25 µg/ratón (grupo B) y 50 µg/ratón (grupo C). Los animales fueron sacrificados 3 días después de la última inyección. Se contempló en el diseño, además, un grupo control compuesto por 7 ratones inoculados con salina fisiológica en un esquema similar al de los grupos experimentales.


Determinación del número de células del exudado peritoneal

A los ratones, una vez sacrificados, se les administró intraperitonealmente 5 mL de buffer fosfato salino pH 7,4 suplementado con albúmina sérica bovina (BSA, 1 mg/mL). El líquido peritoneal se colectó con pipetas Pasteur, estimándose el número total de células por conteo directo en una cámara de Neubaver.7 Se realizaron tinciones de giemsa a muestras de las suspensiones para identificar las poblaciones celulares predominantes. Las observaciones microscópicas se llevaron a cabo en un microscopio JENALUMAR (Carl Zeiss, Jena).


Ensayo de la actividad fosfatasa ácida en macrófagos

A suspensiones celulares conteniendo 1 x 105 (macrófagos) se les adicionó 0,1 mL de tritón X-100 al 0,1 %, 0,2 mL de ß-glicerofosfato de sodio 0,5 mol/L pH 5,0 como sustrato y 0,1 mL de buffer acetato 1 mol/L 5,0. La mezcla de reacción se incubó durante 1 h a 37 °C y la reacción se detuvo con la adición de 1 mL de ácido tricloroacético (TCA) al 8 %. Las muestras se filtraron, tomando 1 mL para la determinación del contenido de fosfatos a través de la reacción de Fiske-Subbarow.8 La actividad enzimática se expresó como nanomoles de fosfato liberados en un minuto por 1 x 105 células.


Análisis de los órganos

Después del sacrificio de los animales, se procedió a su disección y a la extracción del hígado y el bazo. Se realizó el análisis macroscópico cualitativo de estos órganos y se determinó su peso en una balanza analítica AND.


Análisis estadístico

La significación de las diferencias de las medias de los grupos experimentales respecto al control se evaluó mediante el test de la t de Student,9 considerando diferencias significativas cuando la probabilidad de error fuera hasta del 5 %.


RESULTADOS

Los resultados obtenidos indican que el polisacárido en la dosis de 50 mg/ratón y administrado intraperitonealmente de forma repetitiva, incrementó de forma significativa (p < 0,05) el número de células del exudado peritoneal en relación al control, no ocurriendo así en las dosis de 5 y 25 mg/ratón (fig. 1). Se destacaron como poblaciones celulares mayoritarias los macrófagos, células de aspecto linfoide y neutrófilos. Con la dosis de 50 mg/ratón se observaron, además, cambios en la morfología de las células adherentes (macrófagos) que presentaron un mayor tamaño respecto al control, la superficie muy irregular y el citoplasma con una intensa granulación (tabla 1).

Fig.1. Efecto de la fracción PC-I sobre el número de células del exudado peritoneal
Fig.1. Efecto de la fracción PC-I sobre el número de células del exudado peritoneal

TABLA 1. Características morfológicas de las células adherentes del exudado peritoneal

Grupo Experimental
Características
Control
Células redondeadas de superficie uniforme.
A
Células de mayor tamaño respecto al control y superficie algo irregular.
B
Células de mayor tamaño respecto al control y superficie algo irregular.
C
Células de mayor tamaño respecto al control, superficie muy irregular y presencia de abundantes
 
gránulos en su citoplasma.

Desde el punto de vista metabólico, los niveles de actividad de la enzima fosfatasa ácida lisosomal (fig. 2) resultaron superiores en las tres dosis ensayadas respecto al control (p < 0,05).

Fig. 2. Efecto de la fracción PC-I sobre la actividad fosfatasa ácido lisosomal de macrófagos.
Fig. 2. Efecto de la fracción PC-I sobre la actividad fosfatasa ácido lisosomal de macrófagos.

No se detectaron granulomas ni otras alteraciones macroscópicas en los sitios de inoculación y aunque las 3 dosis ensayadas arrojaron discretos aumentos en el peso del hígado, las diferencias respecto al control no resultaron estadísticamente significativas. Con las dosis de 5 y 50 mg/ratón se observó un ligero incremento de la masa esplénica (tabla 2).


TABLA 2. Peso del hígado y bazo en las diferentes variantes al término del período experimental

Peso de los órganos (gr)
Grupos 
n
Hígado
Bazo
Control
7
1,1855 ± 0,3678
0,0981 ± 0,0216
A
10
1,4014 ± 0,4893
0,1293 ± 0,0393 (a)
B
10
1,3234 ± 0,4657
0,1242 ± 0,0568
C
10
1,3170 ± 0,3948
0,1384 ± 0,0360 (a)

(a) Diferencias significativas respecto al grupo control (p < 0,05, test de la t de Student).


DISCUSIÓN

Con la perspectiva de desarrollar nuevos modificadores de la respuesta biológica, útiles en la inmunoquimioterapia del cáncer, se han investigado las propiedades antitumorales e inmunomoduladoras de numerosos polisacáridos como el lentinan, el esquizofilan y el OK-432.

Sin embargo, los esfuerzos orientados a la búsqueda de productos inmunoterapéuticos desprovistos de efectos adversos continúan a un ritmo vertiginoso.10,11

Los polisacáridos, desde los estudios realizados con el zimosan, han sido señalados como activadores de la función de los macrófagos. Es por ello, que la evaluación de cualquier inmunomodulador de origen polisacarídico debe incluir su influencia sobre la actividad de estas células.12

Estos resultados demostraron que la fracción PC-I en la dosis de 50 mg/ratón incrementó de forma significativa el número de células del exudado peritoneal, destacándose los macrófagos como la población mayoritaria. La mayor proliferación celular observada con esta dosis podría estar relacionada con la menor solubilidad en agua del polisacárido, reportándose en la literatura que el reconocimiento de las sustancias insolubles como el zimosan por las células fagocitarias se verifica con una eficiencia superior.13

El efecto in vivo del polisacárido sobre el estado funcional de los macrófagos fue evaluado mediante la determinación de la actividad de la enzima fosfatasa ácida lisosomal, resultando los niveles de actividad superiores en las 3 dosis ensayadas respecto al control. Se conoce que la actividad de esta enzima es estimulada por el componente C3b de la vía alternativa del complemento,13 por lo tanto, la fracción evaluada podría actuar como inductora de esta vía.

La activación de la fosfatasa ácida lisosomal de macrófagos se relaciona estrechamente con el efecto antitumoral sobre el sarcoma 180 de las fracciones polisacarídicas AT-HW y AT-AL aisladas de los cuerpos fructíferos de Armillariella tabescens.13 Los resultados preliminares obtenidos en el presente trabajo en relación a la activación de la enzima por la fracción PC-I estimulan la realización de estudios experimentales dirigidos a evaluar sus posibles propiedades antitumorales.

La administración de glucanos por la vía endovenosa puede estar asociada, en algunos casos, a efectos no deseables como la formación de granulomas, microembolismos y el desarrollo de hepatoesplenomegalia, lo cual depende en gran medida de sus propiedades físico-químicas.14

Con el régimen de administración utilizado y la vía intraperitoneal, no se detectaron al término del período experimental granulomas ni otras alteraciones macroscópicas en los sitios de inoculación.

El efecto inmunopotenciador del polisacárido a las dosis ensayadas se reflejó, además, en el incremento de peso observado en hígado y bazo, importantes órganos del sistema fagocítico mononuclear. El análisis macroscópico no manifestó alteraciones visibles en el volumen, consistencia y color, posibles indicadores de toxicidad, en relación al grupo control.

Estos resultados constituyen evidencias preliminares de la actividad inmunomoduladora de la fracción polisacárida PC-I y sugieren la necesidad de desarrollar estudios adicionales para investigar su efecto sobre otros elementos de la respuesta inmune humoral y mediada por células y dilucidar su mecanismo de acción.


SUMMARY

This paper presents the preliminary results of the evaluation of the immunomodulating action of polysaccharide fraction PC-1 isolated from cultures of microalfae Porphyridium cruentum in stationary phase and repeatedly administered to Balb/c mice in doses of 5, 25 and 50 mg by intraperitoneal route. In the 50 mg dose, the polysaccharide significantly increased (p< 0.05) the number of cells present in the peritoneal exudate in which also morphological changes were observed. The activity of lysosomal acid phosphatase enzyme was higher in the 3 tested doses compared with the control (saline solution). This suggests a possible stimulation of the metabolic and functional action of the phagocytic system cells. On the other hand, neither granulomas nor macroscopic alterations were detected in the inoculation sites. In 5 and 50 mg dose administrations, a slight increase of spelling mass was observed in mice.

Subject headings: ALGAE/isolation of purification; POLYSACCHARIDES; MACROPHAGES, PERITONEAL; ADJUVANTS, IMMUNOLOGIC; MICE; INBRED BALB C.


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Recibido: 3 de abril del 2000. Aprobado: 7 de junio del 2000.
Lic. Humberto J. Morris Quevedo. Centro de Estudios de Biotecnología Industrial. Universidad de Oriente. Ave. Patricio Lumumba, Santiago de Cuba, Cuba.
 
 

1 Licenciado en Bioquímica. Aspirante a Investigador.
2 Licenciada en Biología, M. Sc. en Biotecnología. Profesora Auxiliar.
3 Licenciado en Química, M. Sc en Ciencias Químicas. Investigador Agregado.
4 Licenciado en Biología y Química, M. Sc en Biotecnología. Profesor Asistente.
 

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