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Rev Cubana Oncol 2001;17(2):111-7

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Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología

Determinación de la toxicidad en dosis reiteradas del asencial

Lic. Rita M. Pérez Gil,1 Lic., Marta Montalvo Duquesne,2 Dr. Juan C. Rodríguez Arrecochea,3 Lic. Carlos F. Calderón Marín,4 Dra. Julia Cruz Mojarrieta5 y Dr. José L. Bello Gárciga6

Resumen

Para comenzar los ensayos clínicos en humanos del producto asencial es necesario realizar la determinación de la toxicidad en dosis reiteradas, en roedores, ya que para este producto se propone la administración en más de una ocasión a los pacientes. Es objetivo de este trabajo, evaluar la toxicidad, después de administraciones reiteradas, del asencial en ratas machos de la línea Sprague Dawley. Se evaluaron 3 niveles de dosis 2, 1 y 0,5 mL/kg por día, administrado por vía endovenosa. El peso corporal, así como el consumo de agua y alimentos se registró semanalmente. Se realizaron 2 muestreos, el primero al día siguiente de la última administración y el segundo transcurridos 14 días, determinándose algunos índices hematológicos y bioquímicos incluidos los niveles en suero de las enzimas. El blanco de la acción tóxica del preparado asencial es el hígado. El asencial en dosis de 1 y 0,5 mL/kg no resulta letal cuando se administra reiteradamente a ratas machos de la línea sprague dawley, hasta dosis acumulativas de 20 mL/kg y 10 mL/kg, respectivamente.

DeCS: ENSAYOS CLINICOS/métodos; AGENTES ANTINEOPLASICOS/toxicidad; RATAS DE CEPAS CONSANGUINEAS.

La formación de focos metastásicos constituye un problema que aparece en los tratamientos utilizados en la terapia del cáncer. Las diferencias estructurales entre las células tumorales y las metastizantes traen como consecuencia diferencias en la sensibilidad a los citostáticos, que provocan que se destruya el grueso de la masa tumoral primaria, pero sobrevivan algunos clones que son resistentes y tengan la posibilidad de generar un crecimiento tumoral secundario.1 Por esta razón la búsqueda de nuevos productos no sólo está dirigida a encontrar aquellos que inhiban el crecimiento del tumor primario, sino también a los que producen la disminución o inhibición de las metástasis.

En el laboratorio de Oncofarmacología del INOR fue evaluada la actividad antitumoral del preparado 1x2 en estudios in vitro e in vivo.

En las líneas celulares tumorales evaluadas se encontró la mayor citotoxicidad en la línea de melanoma B-16 resultando de especial interés la no aparición de resistencia cruzada del preparado a los citostáticos 5FU y doxorubicina.

Los estudios in vivo indican que la actividad antitumoral del producto se manifiesta a través de la inhibición de la metastización encontrada en 3 líneas de tumores trasplantables de ratón de reconocido uso en el estudio de metástasis experimentales.

Para la realización de ensayos clínicos en humanos del producto asencial se propone que se administre en más de una ocasión a los pacientes, lo que hace necesario la realización de estudios de toxicidad en dosis reiteradas en roedores y es dentro de este tema que se inserta el objetivo de este trabajo, que consiste en evaluar la toxicidad después de 20 administraciones, del asencial en ratas machos de la línea sprague dawley.

Métodos

Sustancia de ensayo

El producto asencial producido por el Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM) en colaboración con Mediterránea Médica (España). Este producto tiene entre sus componentes el ácido benzoico, una sal de magnesio y clor

hidrato de quinina en una solución al 50 % de propilenglicol en bulbos para la administración parenteral que contienen 10 mL del producto. Se utilizó solución salina fisiológica como control.

Diseño experimental

Este estudio se realizó en ratas machos de la línea sprague dawley con peso corporal de 280 a 370 g. Los animales fueron distribuidos al azar en 4 grupos experimentales de 10 animales cada uno. Las ratas provinieron del Centro Nacional de Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB).

Los animales se mantuvieron en cajas plásticas T4 con lecho de bagazo de caña prensado y esterilizado a razón de 5 animales por caja durante el período de adaptación y de realización del ensayo. Las condiciones de mantenimiento fueron las normadas para la especie. Los animales fueron identificados mediante tinción con ácido pícrico. Las ratas fueron alimen-tadas con pienso, procedente del CENPALAB. En cada caja se colocaron 500 g de pienso y 500 mL de agua, controlándose el consumo de agua y pienso, cada 3 días. Los animales fueron mantenidos a temperaturas entre 21 y 25 °C, con 10 cambios de aire por hora y los ciclos de luz fueron de 12 h por día.

Partiendo de realizar un tanteo de toxicidad preliminar en ratas sprague dawley donde se definió que la dosis de 5 y 3 mL/kg resultaba letal para los animales, se decidió hacer este ensayo de toxicidad acumu-lativa con 3 niveles de dosis de 2, 1 y 0,5 mL/kg por día.

A los animales se les administraron las dosis respectivas por la vena de cola durante 20 días, en ciclos semanales de 5 días consecutivos, teniendo en cuenta las variaciones de peso semanal. El grupo control recibió 0,25 mL de solución salina fisiológica para cada animal.

Una vez administrado el producto, las ratas fueron observadas con las posibles alteraciones en su comportamiento o aparición de mortalidad; manteniéndose estas observaciones durante todo el experimento. El peso corporal se registró semanalmente, así como el consumo de agua y alimentos.

Al día siguiente de la última administración se procedió a sacrificar por elongación cervical, 5 animales (primer muestreo) con vistas a evaluar algunos índices fisiológicos, así como las posibles alteraciones anatomopatológicas de forma macroscópica que pudieran manifestarse. A los 14 días de finalizado el tratamiento se sacrificó el resto de los animales (segundo muestreo) con vistas a valorar alteraciones tardías.

Se realizó la determinación de algunos índices hematológicos y bioquímicos: hematócrito, trombocitos, leucocitos, conteo diferencial de leucocitos, contenido de colesterol, contenido de glucosa en sangre, proteínas totales, creatinina, así como los niveles de las enzimas alanina--amino transferasa (ALAT) y aspartato--amino transferasa (ASAT) en el suero,2 una vez concluidos los 2 muestreos realizados. La toma de muestra de sangre se efectuó por la vena femoral de las ratas, previamente anestesiados con éter.

Al realizar la necropsia se llevó a cabo la descripción macroscópica de los órganos y se registró el peso de los mismos. Se extrajeron: hígado, bazo, riñones, timo, corazón, gónadas y pulmones. Las muestras extraídas de las necropsias fueron conservadas en formol al 10 %, incluyéndose en parafina y se cortaron en un micrótomo (820 Spencer, American Optical Corp) a un grosor de 4 a 5 mm. Se usó la técnica tradicional de coloración con hematoxilina-eosina para la realización de los estudios de histopatología. Durante la realización del ensayo se cumplimentaron las buenas prácticas de laboratorio y garantía de la calidad.3

Análisis estadístico

Se calcularon las medias aritméticas y las desviaciones estándares para las variables estudiadas. La comparación entre los grupos experimentales para la búsqueda de diferencias estadísticamente significativas de los índices hematológicos y bioquímicos así como el peso de los diferentes órganos analizados se realizó usando la prueba no paramétrica de Kruskal--Wallis, auxiliados por el programa SPSS para Windows (SPSS release 5.0.1 Octubre 09/1992), con un nivel de significación de 95 %.

En los casos de las variables en las que se encuentren diferencias significativas se procedió a la aplicación del test de Mann Whitney U-Wilcoxon.

Resultados

La administración endovenosa del producto asencial se acompañó de letargo y no coordinación ligeras en los movimientos de los animales, sobre todo en aquellos que reciben la dosis mayor; estas manifestaciones no están presentes en todos los animales y se van perdiendo a medida que aumenta la cantidad de administraciones.

Durante el tratamiento se registró un 30 % de mortalidad en la dosis de 2 mL/kg, no siendo así en ninguna de las dosis menores ensayadas del producto. La mortalidad encontrada se produjo en un animal después de 6 administraciones del producto; en los 2 restantes a las 15 y 16 administraciones, respectivamente. La primera y la tercera muerte se registraron después de la administración del preparado, no así la segunda que ocurrió durante la noche.

El peso corporal (tabla 1) se incrementa en todos los grupos a lo largo del período de tratamiento y observación, solo en la dosis mayor de 2 mL/kg no existe aumento del peso corporal en la primera semana del tratamiento. El consumo de alimentos fue ligeramente menor en los animales tratados con la dosis mayor de 2 mL/kg.

Tabla 1. Variación del peso corporal (g) de las ratas machos tratadas con el producto asencial

 
Dosis (mL/kg)

Peso inicial

Días durante el tratamiento

Días después de finalizado el tratamiento
7 14 21 28 9 16 24

2,0

215,37±10,90
216,27±36,52
280,80±12,75
287,30±78,54
314,30±34,09
336,16±13,19
336,16±13,19
318,38±12,99

1,0

188,60±29,64
247,66±18,23
270,83±17,20
260,07±86,07
298,39±17,91
321,28±18,74
321,28±18,74
332,62±39,18

0,5

212,72±18,00
252,80±19,02
283,46±17,56
324,26±19,26
330,48±25,59
320,46±14,84
320,46±14,84
314,90±31,32

Control

185,64±25,12
233,30±24,62
280,80±25,20
329,90±15,71
310,00±38,28
353,14±9,02
353,14±9,02
328,42±4,17

 

En los estudios hematológicos realizados (tablas 2 y 3), sólo en el caso de la hemoglobina se encontraron diferencias significativas (p<0,05) en el primer mues-treo, entre los grupos tratados y el grupo control, donde se observó una concentración menor de la misma en los animales tratados, aunque las disminuciones se encuentran comprendidas dentro del rango normal calculados para la especie con el mismo método de cuantificación (tabla 4) y con relación a los valores normales reportados en ratas pertenecientes a esta especie.4 Desde el punto de vista de la bioquímica sanguínea, en el primer muestreo (tabla 5) se observó solamente diferencia significativa para la creatinina entre todas las dosis evaluadas del producto y el grupo control (p<0,05), pero esto se debe a los valores menores en la concentración de creatinina obtenidos para los grupos tratados con el 1x2. En el segundo muestreo (tabla 6) no existen diferencias significativas para los índices evaluados y el grupo control (p<0,05), aunque la actividad de la enzima ALAT sérica en las dosis de 1 y 0,5 mL/kg mostró un aumento que pudiera estar relacionado con la hepatotoxicidad del producto.

Tabla 2. Algunos índices hematológicos de las ratas machos tratadas con el producto asencial el día después de terminado el tratamiento (primer muestreo)

 

Dosis

Leucocitos
Trombocitos
Hemoglobina
Hematócrito
Linfocitos
Polimorfos

(mL/kg)

(x 109/L)
(x 109/L)
(g/L)
2,0

12,1±0,49

207,5±14,7
147,8±0,25
0,48±0,03
0,65±0,09
0,32±0,10

1,0

10,7±0,45
228,0±41,7
143,6±0,10
0,50±0,01
0,66±0,07
0,34±0,06

0,5

10,4±0,45
226,0±37,7
159,4±0,36
0,49±0,02
0,67±0,03
0,30±0,06

Control

12,2±
277,2±30,4
155,1±0,42
0,51±0,02
0,69±0,07
0,24±0,13

 

Tabla 3. Algunos índices hematológicos de las ratas machos tratadas con el producto asencial a los 14 días después de terminado el tratamiento (segundo muestreo)

 

Dosis

Leucocitos
Trombocitos
Hemoglobina
Hematócrito
Linfocitos
Polimorfos

(mL/kg)

(x 109/L)
(x 109/L)
(g/L)

2,0

11,4±1,77
496,66±41,09
153,67±0,47
0,47±0,01
0,67±0,09
0,32±0,09

1,0

11,0±1,96
446,00±55,35
156,00±2,53
0,48±0,01
0,82±0,04
0,17±0,05

0,5

10,4±1,08
432,00±51,92
156,80±2,63
0,48±0,01
0,80±0,04
0,17±0,05

Control

8,16±1,72
378,00±54,18
160,00±1,26
0,46±0,10
0,82±0,04
0,15±0,03

 

Tabla 4. Valores normales de la población de ratas mantenidas en el Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología

 

Valor

n
x ± u
Rango

Hemoglobina (g/L)

34
14,6 ± 3,358
13,8 - 6,7

Hematócrito

34
0,47 ± 0,03
0,40 - 0,51

Trombocitos (x 10 g/L)

34
463,10 ± 207,00
220 - 900

Leucocitos (x 10 g/L)

34
10,26 ± 2,05
7,00 - 15,60

Polimorfonucleares

34
0,17 ± 0,08
0,08 - 0,37

Linfocitos

34
0,81 ± 0,09
0,67 - 0,90

Glucosa (mMoles/L)

34
8,99 ± 3,45
5,0 - 15,8

Colesterol (mMoles/L)

25
2,79 ± 1,05
1,5 - 5,1

Creatinina (mMoles/L)

33
92,06 ± 30,64
51 - 16,5

Proteínas totales (g/L)

31
64,40 ± 12,47
36,5 - 78

GOT

27
41,27 ± 9,36
31 - 67,2

GPT

34
22,94 ± 17,38
9,6 - 42,6

 

Tabla 5. Algunos índices de bioquímica sanguínea y actividad enzimática en el suero de las ratas machos tratadas con el producto asencial el día después de terminado el tratamiento (primer muestreo)

 

Dosis

(mL/kg)

 

Proteínas totales
Creatinina (g/L)
Glucosa (mmoles/L) (mmoles/L)
Colesterol (mmoles/L)
ALAT (U.I./I)
ASAT (U.I./I)

2,0

67,80±1,36
113,5±7,79
5,30±0,69
2,92±0,15
23,0±2,63
35,72±2,07
1,0

65,38±2,35

104,2±4,09
5,42±0,79
2,88±0,20
29,6±13,29
33,66±4,03

0,5

68,12±2,21
116,2±17,3
5,40±0,57
3,29±0,34
25,7±3,52
34,20±3,80

Control

69,92±4,34
135,8±17,5
5,30±1,40
2,47±0,33
26,8±8,00
35,82±4,37

 

En ambos muestreos se encuentra un incremento del porcentaje del peso relativo del bazo (tablas 7 y 8) en la dosis de 2 mL/kg, aunque este aumento no fue significativo con respecto al grupo control. Es de destacar al realizar el análisis ana-tomopatológico (primer muestreo), la congestión en los hígados, que puede ser parte de un proceso inflamatorio, consecuencia de la acción tóxica del producto. En el segundo muestreo (tabla 8) se observa un aumento significativo del porcentaje del peso relativo del hígado en todos los grupos tratados como alteración más importante.

Las alteraciones histopatológicas más notables también se observaron en el hígado. En los animales que murieron está presente la degeneración grasa y las zonas de necrosis, por lo que la muerte puede asociarse con la acción tóxica del preparado. La hiperemia o congestión presente en los hígados de los animales tratados puede formar parte de un proceso inflamatorio debida fundamentalmente a la acción tóxica directa sobre las paredes vasculares como consecuencia del producto estudiado.

Tabla 6. Algunos índices de bioquímica sanguínea y actividad enzimática en el suero de las ratas machos tratadas con el producto asencial a los 14 días después de terminado el tratamiento (segundo muestreo)

 

Dosis

(mL/kg)

Proteínastotales
Creatinina (mmoles/L)
Glucosa (mmoles/L)
Colesterol (mmoles/L)
ALAT(U.I./I)
ASAT (U.I./I)

2,0

52,90±9,17
104,33±18,26
13,50±2,48
1,87±0,32
22,10± 5,35
30,23± 8,01

1,0

54,38±5,44
90,00± 6,66
12,89±1,48
1,54±0,49
53,84±19,38
40,28± 5,82
0,5

52,68±6,68

87,20±11,32
12,12±2,89
1,53±0,25
67,71±20,33
49,52± 7,25

Control

59,60±4,11
119,80±14,52
12,52±1,96
2,26±0,39
48,48±32,79
45,94±11,21

 

Tabla 7. Peso de los órganos (%) de las ratas machos tratadas con el producto asencial el día después de terminado el tratamiento (primer muestreo)

 

Dosis

(mL/kg)

Corazón
Pulmón
Bazo
Riñón
Gónadas
Cerebro
Hígado

2,0

0,39±0,02
0,73±0,18
0,26±0,01
0,80±0,05
1,56±0,18
0,54±0,03
3,00±0,15

1,0

0,43±0,04
0,53±0,02
0,26±0,03
0,84±0,05
1,61±0,10
0,58±0,10
3,13±0,15

0,5

0,40±0,08
0,46±0,02
0,21±0,01
0,82±0,09
1,44±0,08
0,44±0,10
2,91±0,09

Control

0,42±0,09
0,57±0,04
0,27±0,06
0,87±0,15
1,69±0,22
0,58±0,10
3,54±0,56

 

Tabla 8. Peso de los órganos (%) de las ratas machos tratadas con el producto asencial a los 14 días de terminado el tratamiento (segundo muestreo)

 

Dosis

(mg/kg)

Corazón
Pulmón
Bazo
Riñón
Gónadas
Cerebro
Hígado

2,0

0,34±0,03
0,47±0,05
0,22±0,01
0,79±0,07
1,18±0,27
0,41±0,01
4,38±0,18

1,0

0,35±0,03
0,51±0,05
0,18±0,03
0,69±0,03
1,19±0,39
0,43±0,06
4,03±0,34

0,5

0,33±0,01
0,43±0,02
0,18±0,04
0,70±0,04
1,19±0,21
0,45±0,07
4,07±0,19

Control

0,38±0,03
0,45±0,05
0,19±0,06
0,74±0,07
1,29±0,16
0,49±0,09
3,27±0,11

 

Discusión

El preparado asencial contiene varios productos, por lo que se evaluación toxicológica es compleja sin embargo, como característica propia de su toxicidad se debe tener en cuenta la ligera disminución de la hemoglobina.

El blanco de la acción tóxica parece ser el hígado, provocando alteraciones necróticas en las dosis altas y en las dosis más pequeñas, están presentes las alteraciones que preceden a las mismas. Resulta de interés la metamorfosis grasa que se observa con las distintas dosis administradas y que también es un índice de afección hepática, aunque en las ratas no se observó un incremento elevado en los valores de la enzima ALAT.

Conclusiones

La dosis de 2 mL/kg resultó letal cuando se administró de 2 a 3 sem, el blanco de la acción tóxica del preparado asencial es el hígado, fundamentalmente y al administrar reiteradamente (20 administraciones) el producto 1x2 en dosis de 1 y 0,5 mL/kg para lograr dosis acumulativas de 20 mL/kg y 10 mL/kg no se manifiesta letalidad en las ratas machos de la línea sprague dawley.

SUMMARY

To begin the clinical assays in humans of the product asencial it is necessary to determine its toxicity at repeated doses in rodents, since this product is proposed to be administered to patients more than once. This paper is aimed at evaluating the toxicity of asencial after repeated doses in Sprague Dawley male rats. Three dose levels of 2, 1 and 0.5 mL/kg per day were endovenously administered and evaluated. Body weight as well as water and food consumption were weekly registered. Two samplings were taken, the first one the day after the last administration and the second 14 days later. Some hematological and biochemical indexes including the enzyme levels in serum were determined. The target of the toxic action of asencial is the liver. Asencial at doses of 1 and 0.5 mL/kg is not lethal when it is repeatedly administered to Sprague Dawley male rats up to accumulative doses of 20 mL/kg and 10 mL/kg, respectively.

Subject headings: CLINICAL TRIALS/methods; ANTINEOPLASTIC AGENTS/toxicity; RATS, INBRED STRAINS.

Referencias bibliográficas

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Recibido: 10 de abril de 2001. Aprobado: 30 de abril de 2001.
Lic. Rita M. Pérez Gil. Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología. Calle 29 esquina a E, El Vedado, Ciudad de La Habana, Cuba.

1 Investigador Auxiliar.
2 Aspirante Investigador.
3 Especialista en cría de animales.
4 Investigador Agregado.
5 Especialista de II Grado en Anatomía Patológica.
6 Investigador Titular.

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