ARTÍCULO ORIGINAL

 

Genotoxicidad de Justicia pectoralis Jacq. (tilo)

 

Genotocixity of Justicia pectoralis Jacq. (tilo)

 

 

Antonia C. Remigio MonteroI; Yamilé Vega HurtadoII; Janet Piloto FerrerIII; Jorge Rodríguez ChanfrauIV

I Máster en Ciencias Investigador Auxiliar. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). La Habana, Cuba.
II Técnica en Procesos Biológicos. CIDEM. La Habana, Cuba.
III Licenciada en Biología. Investigadora Agregada. CIDEM. La Habana, Cuba.
IV Licenciado en Química. Investigador Auxiliar. CIDEM. La Habana, Cuba.

 

 

 


RESUMEN

Objetivo: determinar el efecto genotóxico del extracto hidroalcohólico 30 % de partes aéreas de Justicia pectoralis Jacq. (variedad pectoralis) secado por spray dryer.
Métodos
: se empleó el ensayo Salmonella/microsomas con las líneas TA 1535, TA 1537, TA 98 y TA 100 con un rango de concentraciones de 50 a 5 000 mg de polvo/placa (± S9) según el protocolo de incorporación en placas; para el ensayo de micronúcleos en médula ósea se utilizaron ratones Cenp: NMRI de los 2 sexos, que recibieron dosis isovolumétricas (10 mL/kg) de 500, 1 000 y 2 000 mg de polvo/kg, por vía intragástrica, separadas 24 h, con sacrificio 24 h después de la última aplicación.
Resultados
: no se encontró efecto genotóxico con ninguna de las cepas en el ensayo de Salmonella/microsomas y el extracto no causó un aumento estadísticamente significativo en la frecuencia de eritrocitos policromáticos micronucleados en los ratones tratados y no mostró relación dosis respuesta positiva.
Conclusiones
: el polvo no reveló efecto genotóxico en las condiciones experimentales de este estudio.

Palabras clave: Genotoxicidad, médula ósea, micronúcleos, Justicia pectoralis Jacq., Salmonella/microsomas.


ABSTRACT

Objective: to detemine the genotoxic effect of the hydroalcoholic extract 30 % of aerial parts of Justicia pectoralis Jacq. (variety pectoralis) dried by spray drier.
Methods:
the Salmonella/microsomes with lines TA 1535, TA 1537, TA 98 and TA 100 with a concentration range from 50 to 5 000 ìg of powder/plaque (± S9) was used according to the protocol of incorporation in plaques; for the bone marrow micronucleus assay there were used Cenp mice: NMRI of both sexes that received isovolumetric doses (10 mL/kg) of 500, 1 000 y 2 000 mg of powder/kg by intragastric route at intervals of 24 h and were sacrificed 24 h after the last application.
Results:
no genotoxic effect was found with any of the strains in the assay of Salmonella/microsomes. The extract did not cause a statistically significant increase in the frequency of micronucleated polychromatic erythrocytes in the mice treated. No dose/positive response relation was observed.
Conclusions:
the powder did not reveal genotoxic effect under the experimental conditions of this study.

Key words: Genotoxicity, bone marrow, micronuclei, Justicia pectoralis Jacq., Salmonella/microsomes.


 

INTRODUCCIÓN

El estudio del potencial genotóxico de compuestos usados como fármacos, constituye una vía para la determinación de riesgo de daño genético en las personas expuestas, así como un camino para la toma de decisiones en relación con las medidas de protección imprescindibles para la preservación de la salud humana. Esto adquiere mucha importancia por la alta correlación que existe entre el daño al ADN y las enfermedades hereditarias, así como también entre este y las afectaciones somáticas de diverso origen y naturaleza como el envejecimiento y el cáncer.

Dado a lo anterior, resulta imprescindible la evaluación de la actividad genética de las plantas medicinales, sus extractos y de las formulaciones que se hagan, para que estas puedan ser incorporadas a la medicina actual y aumentar el arsenal de productos farmacéuticos.

Justicia pectoralis Jacq. es una especie vegetal de la familia Acantaceae, nativa de los trópicos de América, se encuentra tanto en las Antillas como en la zona continental. En Cuba es conocida como tilo o tila, carpintero o té criollo.1 Su uso etnomédico más común es como sedante, aunque también ha sido utilizada como "pectoral".2

Lino y otros3 demostraron que la presencia de coumarina y umbeliferona en J. pectoralis aporta las propiedades antiinflamatorias y analgésicas que popularmente se le atribuyen por la población de diferentes regiones del Caribe y Centroamérica.

En el presente trabajo se evalúa la genotoxicidad del polvo seco de J. pectoralis Jacq. (variedad pectoralis) a través de 2 ensayos a corto plazo: Salmonella/microsomas (test de Ames) para mutación génica y el ensayo de micronúcleos en médula ósea de ratón que mide efectos clastogénicos y aneugénicos in vivo.

 

MÉTODOS

Se elaboró un extracto hidroalcohólico 30 % (volumen total de 15 L), de partes aéreas secas, por el método de repercolación (4 extracciones); se concentró por rotoevaporación (volumen total de 10 L) hasta eliminación total del contenido de etanol y se almacenó a una temperatura entre 5 y 8 ºC, hasta el momento de realizar el secado por spray dryer. Se utilizó el polvo seco de Justicia pectoralis Jacq. (voucher ROIG 4636) (polvo fino de color carmelita claro, higroscópico, soluble en agua) y solución hidroalcohólica 30 %, con identificación de coumarinas, polifenoles totales, aminoácidos, aminas y flavonoides, obtenido mediante un proceso tecnológico desarrollado en el Departamento de Productos Naturales del Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). Este fue analizado según técnica de control de calidad establecida también en el centro.

Las pruebas se ejecutaron siguiendo las líneas directrices de la OECD y de la Comunidad Económica Europea para los ensayos de genotoxicidad.4,5

Ensayo Salmonella/Microsoma (Ames). Se utilizaron las líneas de Salmonella typhimurium recomendadas internacionalmente para esta prueba, TA 1535, TA 1537, TA 98 y TA 100 (que fueron enviadas por el doctor Bruce N. Ames-Universidad de California en Berkeley, USA), con el empleo del método de incorporación en placas. Se evaluaron 5 concentraciones del extracto de Justicia pectoralis Jacq. en un rango de 50 a 5 000 mg de sólidos/placa, se sembraron 3 placas por cada concentración en un experimento único.6 La fracción microsomal S9 fue preparada a partir de hígado de ratas Wistar tratadas con fenobarbital y 5,6 benzoflavona.7 La mezcla S9 utilizada para la activación metabólica externa contenía 4 % de fracción S9 en una solución de cofactores.8 Las colonias revertantes se contaron manualmente después de 48 h de incubación a 37 ºC.

Los resultados se analizaron utilizando el programa SALANAL versión 1.0 (ILS, Research Triangle Park, NC, USA), que permite calcular la significación estadística de las diferencias observadas entre las frecuencias promedio correspondientes al control y los tratamientos. Asimismo, es posible valorar si los efectos observados mantienen una relación proporcional a estas concentraciones (relación dosis-respuesta). Como criterios de genotoxicidad se asumieron: aumentos significativos y dosis dependientes en la frecuencia de revertantes.

Ensayo de micronúcleos en médula ósea. Se utilizaron ratones Cenp: NMRI entre 8 y 12 semanas de edad y 25-30 g de peso corporal, suministrados por el Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB). Los animales fueron distribuidos de manera aleatoria por grupos de tratamiento en cajas de Macrolon tipo T3, encamadas con bagacillo de caña previamente esterilizado a 120 °C durante 20 min, mantenidos bajo condiciones controladas9 de temperatura (21 a 25 °C), humedad relativa (40 a 70 %) y con ciclos normales de luz-oscuridad de 12 h. Fueron provistos con la dieta comercial, fórmula EMO 1001 y agua ad libitum (acidulada con ácido clorhídrico hasta un pH de 2,4 a 2,5) para satisfacer sus requerimientos nutricionales.

Se establecieron 5 grupos experimentales: control negativo (etanol 40 %), control positivo (ciclofosfamida 40 mg/kg) y 3 dosis del polvo seco 500, 1 000 y 2 000 mg/kg administrados en un volumen de 10 mL/kg por vía intragástrica.

El esquema de tratamiento consistió en 2 administraciones, separadas entre sí 24 h. Los animales fueron sacrificados a las 24 h de la última administración; este tiempo de muestreo está basado en la cinética de maduración de los eritrocitos en ratones.10

El procedimiento empleado para la obtención de las preparaciones de la médula ósea, fue realizado de acuerdo con la metodología propuesta por Schmid.11 Con este procedimiento se obtiene una tinción diferencial entre los eritrocitos policromáticos (PCE) y los eritrocitos normocromáticos (NCE). Se cuantifica el número de PCE portadores de micronúcleos (PCE-MN) y se expresa como porcentaje con respecto al total de PCE observados (2 000 por animal).

Las diferencias entre el grupo control negativo y los grupos tratados, fue analizada con los conteos reales para ambos índices después de adecuadas trasformaciones de escala al efectuar las pruebas de Kolmogorov-Smirnov y Bartlett. Posteriormente se realizó un análisis de varianza (ANOVA) bifactorial.

Los criterios de genotoxicidad tomados fueron los recomendados por Hayashi,12 significación estadística del incremento del porcentaje PCE-MN en una dosis o más con respecto al control negativo. Como criterio de toxicidad se tomó la significación estadística de la disminución de la proporción PCE/NCE en una dosis o más con respecto al control negativo.13

 

RESULTADOS

En la tabla se resumen los resultados del ensayo de Ames. Se encontró una disminución significativa de la frecuencia de revertantes por colonia para la cepa TA 98 sin activación metabólica exógena, a partir de la concentración de 1 500 µg/placa; sin embargo, en presencia de S9, la frecuencia de revertantes se recupera parcialmente. Por otro lado, en la dosis de 5 000 µg/placa para la cepa TA 100 (+ S9) se observó un aumento de los revertantes, aunque se trata de un incremento que no llega a duplicar la frecuencia del control negativo.

El índice de toxicidad (IT) en ratones machos para el grupo control fue de 1,53 ± 0,10; no se encontraron diferencias significativas al comparar estos resultados con el grupo tratado con el extracto (p< 0,05), que correspondieron a 1,37 ± 0,07 para la dosis de 500 mg/kg de peso corporal, 1,60 ± 0,16 para la dosis de 1 000 mg/kg y 1,03 ± 0,09 para la dosis de 2 000 mg/kg de peso corporal, respectivamente; en el caso del grupo tratado con ciclofosfamida en la diferencia resultó significativa al compararla con el resto de los grupos estudiados, al mostrar un índice de citotoxicidad de 0,26 ± 0,22. Los resultados obtenidos en los grupos tratados con las diferentes concentraciones del extracto no difirieron entre ellos, como tampoco con el grupo control negativo que correspondió al vehículo alcohólico.

Por otro lado, para las hembras, los valores obtenidos en el IT se pueden apreciar algunos similares a los obtenidos en el grupo de los machos, así, el control negativo mostró un índice de citotoxicidad de 1,55 ± 0,18; estos valores no se diferenciaron de los encontrados en los grupos a los que se les administró el polvo seco, que fueron de 1,71 ± 0,06; 1,15 ± 0,14; 1,28 ± 0,32 para las dosis de 500, 1 000 y 2 000 mg/kg de peso corporal, respectivamente, para p< 0,05. El valor obtenido con ciclofosfamida fue inferior a todos los grupos tratados, con un índice de citotoxicidad de 0,26 ± 0,22, diferente significativamente del resto de los tratamientos, p< 0,05.

De acuerdo con los resultados por sexo, en cada uno de los grupos y dosis no se observaron diferencias significativas, p< 0,05.

 

DISCUSIÓN

La ausencia de mutagenicidad de J. pectoralis en el sistema de reversión bacteriana empleado, salvo un débil efecto en TA 100, pudiera ser atribuida a la presencia de compuestos polifenólicos, metabolitos considerados mayoritarios en el polvo seco de J. pectorales, cuya actividad principal es su efecto antioxidante, basada en la capacidad de atrapar o secuestrar especies reactivas del oxígeno (ERO), radicales lipídicos, etc., y formar radicales polifenólicos más estables.14,15

Por otra parte, los resultados del presente trabajo indican la ausencia de toxicidad para este extracto, porque no se obtuvo afectación citotóxica de la médula ósea de los ratones tratados, teniendo en cuenta que una disminución de la proporción PCE/NCE en este ensayo es un indicador de la toxicidad medular; no se reportaron diferencias estadísticamente significativas entre las medias de este índice con respecto a las medias del control negativo.

Estos resultados coinciden con la inocuidad determinada en el estudio general de toxicidad para el tilo en ratas Cenp: SPRD, a pesar de que esta planta tiene reportada la presencia de justicidin B un principio citotóxico.16 Esta respuesta negativa contribuye a ampliar los conocimientos toxicogenéticos preclínicos de este producto y respaldar su empleo como medicina natural.

 

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Roig JT. Plantas Medicinales Aromáticas o Venenosas de Cuba. La Habana:Ed. Científico-Técnica; 1974.

2. Duke JA. Handbook of Medicinal Herb. Florida; USA:CRC Press; 1991.

3. Lino CS, Traveira ML, Viana GSB, Matos JJ. Analgesic and antiinflammatory activities of Justicia pectoralis Jacq. and its main constituents: coumarin and umbelliferone. Phytoter Res. 1997;11(3):211-5.

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5. OCDE. Organization for Economic Co-operation and Development. Bacterial Reverse Mutation Test. Guideline for the testing of chemicals. Paris, France:Updated test Guideline 471; 1997.

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7. Gatehouse D, Haworth S, Cebula T, Gocke E, Kier L, Matsushima T, et al. Recommendations for the performance of the bacterial mutation assays. Mutat Res. 1994;312:217-33.

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9. UFAW. Hanbook on the care and management of laboratory animals. 7th ed. vol. 1 Terrestrial vertebrates. Part 3 Species kept in the laboratory. USA:Blackwell Science Ltd; 1999.

10. Gollapudi B, McFadden L. Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test. Mutat Res. 1995;347:97-9.

11. Schmid W. The micronucleus test for cytogenetic analysis. Chemical Mutagens Ed A. Hollaender Plenum. 1976;4:31-53.

12. Hayashi M, Tice R, McGregor J, Romagna F, Pacchierotti F. In vivo rodent erythrocyte micronucleus assay. Mutat Res. 1994;312:293-304.

13. Ribeiro L, Favero DM, Kanan E. Mutagenesis ambiental. Brasil:ULBRA; 2003.

14. Takuo O, Takashi Y, Tsutomu H. Chemistry and antioxidative effects of phenolic compounds from Licorice tea and composite and Labiate Herbs. Chapter 15; 1991.

15. Pérez G, Rivero R, Pardo Z, Rodríguez J. Evaluación de la actividad antioxidante de Justicia pectoralis Jacq. Rev Cubana Invest Biomed. 2001;20(1):30-3.

16. Joseph H, Gleye J, Moulis C, Mensah LJ, Roussakis C, Gratas C. Justicidin B a cytotoxic principle from Justicia pectoralis. J Nat Prod. 1988;51(3):599-600.

 

 

Recibido: 30 de septiembre de 2007.
Aprobado: 28 de enero de 2008.

 

 

M. C. Antonia C. Remigio Montero. Ave. Ceiba No 1523, e/ Segunda y Entrada. Cerro. Ciudad de La Habana. Teléfono: 8810892. Correos electrónicos: antonia@cidem.quimefa.cu; yamile@cidem.quimefa.cu; andres.piloto@infomed.sld.cu; cidem.id@infomed.sld.cu
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