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Revista Cubana de Salud y Trabajo 2014;15(1):35-41

Marcadores de estrés oxidativo y genotoxicidad en trabajadores cubanos con exposición ocupacional prolongada al mercurio
Oxidative stress and genotoxicity biomarkers in Cuban workers with occupational chronic exposure to mercury

Gretel Riverón Forment 1
Jakeline Arencibia Faife 2
Ibis de las Mercedes Fernández Díaz 3
Nino Pedro del Castillo Martín 4
Reinaldo Gutiérrez Gutiérrez 5
Anamarys Pandolfi Blanco 6
Olivia Martínez Bonne 7
Judith Pupo Balboa 8
Roberto Lardoeyt Ferrer 9
Nancy Silvia Barroso Sosa 10
Arelis Jaime Novas 11
Lilian Villalba Rodríguez 12

1 Investigadora Auxiliar. Laboratorio de Estrés Oxidativo, Centro Nacional de Genética Médica, La Habana, Cuba
2 Médico especialista de I grado en Pediatría. Centro Nacional de Genética Médica, La Habana, Cuba
3 Médico especialista de I grado en Medicina General Integral, Máster en Salud de los Trabajadores, Investigadora Agregado, Profesora Instructor. Vicedirección de Atención Médica, Instituto Nacional de Salud de los Trabajadores, La Habana, Cuba
4 Licenciado en Psicología, Máster en Salud de los Trabajadores, Investigador y Profesor Titular. Vicedirección de Investigaciones y Docencia, Instituto Nacional de Salud de los Trabajadores, La Habana, Cuba
5 Investigador Auxiliar. Laboratorio de Estrés Oxidativo, Centro Nacional de Genética Médica, La Habana, Cuba
6 Licenciada en Tecnología de la Salud , perfil de Microbiología. Laboratorio de Estrés Oxidativo, Centro Nacional de Genética Médica, La Habana, Cuba
7 Técnica. Laboratorio de Estrés Oxidativo, Centro Nacional de Genética Médica, La Habana, Cuba
8 Doctora en Ciencias. Investigadora Agregado. Laboratorio de Estrés Oxidativo, Centro Nacional de Genética Médica, La Habana, Cuba
9 Doctor en Ciencias. Profesor Titular. Centro Nacional de Genética Médica, La Habana, Cuba.
10 Licenciada en Tecnología de la Salud , perfil de Laboratorio Clínico. Vicedirección de Atención Médica, Instituto Nacional de Salud de los Trabajadores, La Habana, Cuba
11 Licenciada en Bioquímica Farmacéutica, Máster en Química Farmacéutica, Investigadora Auxiliar. Departamento de Riesgos Químicos, Instituto Nacional de Salud de los Trabajadores, La Habana, Cuba
12 Técnica A Auxiliar de Investigación. Departamento de Riesgos Químicos, Instituto Nacional de Salud de los Trabajadores, La Habana, Cuba

Correspondencia:

Gretel Riverón Forment
Centro Nacional de Genética Médica
Avenida 146 Nº 3102 esquina a 31, Playa, La Habana, Cuba
E-mail: gretel.riveron@infomed.sld.cu


RESUMEN

Objetivo: Determinar el comportamiento de marcadores de estrés oxidativo y genotoxicidad en individuos expuestos ocupacionalmente por tiempos prolongados al mercurio. Material y método: Fue estudiado un total de 55 sujetos, de ellos, 12 trabajadores, con edades comprendidas entre 25 y 56 años, expuestos al mercurio por períodos de 6 a 33 años. El grupo control estuvo conformado por 43 individuos, con edades comprendidas entre 25 y 65 años, sin exposición ocupacional a agentes químicos o físicos. Todos los participantes fueron incluidos luego de emitir su consentimiento informado. Los marcadores de daño oxidativo y de defensa antioxidante, así como, la relación entre las formas reducidas y oxidadas del glutatión, fueron medidos mediante métodos espectrofotométricos. Además, se determinó el daño al ADN mediante el ensayo Cometa. Resultados: Los trabajadores expuestos presentaban un incremento significativo en el daño oxidativo a las proteínas, en el daño en el ADN y en las actividades enzimáticas de la Cu-Zn superóxido dismutasa y la glutatión reductasa. Por otra parte, mostraban una disminución significativa en la actividad de la catalasa, en las concentraciones de grupos tioles, así como en la capacidad antioxidante total. Conclusiones: Los resultados de este estudio suportan el hecho de que la exposición por largos períodos de tiempo al mercurio modifica el estado redox celular, promoviendo condiciones de estrés oxidativo y daños en el material genético.

Palabras clave: mercurio, exposición ocupacional, estrés oxidativo, enzimas antioxidantes, daño oxidativo, ensayo Cometa

ABSTRACT

Objective: To determine the influence of the occupational exposure to mercury on oxidative stress and genotoxicity biomarkers. Material and method: Studies were carried out on 12 workers aged between 25 and 56 years exposed to mercury during their work from 6 to 33 years. The control group consisted of 43 healthy workers aged between 25 and 65 years not exposed to chemical or physical agents. All participants were included after signing the informed consent form. The oxidative stress markers were measured by spectrophotometric methods and DNA damage was determined by the Comet assay. Results: In the group of exposed to mercury, a significant increased was found in oxidative damage to proteins, DNA damage and the activities of the enzymes superoxide dismutase and glutathione reductase. Moreover a significant decreased in catalase activity, concentrations of thiol groups and total antioxidant capacity was found. Conclusions: The present data show that chronic low dose of mercury leads to oxidative stress conditions, which promotes damage to genetic material.

Keywords: mercury, occupational exposure, oxidative stress, antioxidant enzymes, oxidative damage, Comet assay


INTRODUCCIÓN

El mercurio, metal pesado ampliamente utilizado por el hombre, es muy tóxico; produce daños al sistema nervioso central, perturbaciones del comportamiento y afectaciones renales. Se acumula en todos los seres vivos y no es esencial para ningún proceso biológico 1.
Los efectos que puede provocar el mercurio como consecuencia de la exposición a esta sustancia nociva, ha sido objeto de múltiples investigaciones, las que han estado encaminadas a relacionar el grado de exposición y los efectos adversos en el organismo 2,3.
La toxicidad del mercurio está directamente relacionada con su estado químico. En salud ocupacional, la vía más importante de incorporación de este metal es mediante la inhalación, debido a que tanto el mercurio elemental como el inorgánico y sus compuestos, puede ingresar por esta vía y alcanzar la sangre con una eficiencia del 80 % 1.
Numerosos estudios han demostrado que el aumento en la generación de especies reactivas del oxígeno (ERO), la depleción del glutatión reducido (GSH) y la inhibición de la actividad de las principales enzimas antioxidantes, son los mecanismos más importantes mediante los cuales el mercurio induce daño oxidativo, provoca afectaciones en el estado redox celular y, por tanto, daños celulares 4-6 , razón por la cual, en su gran mayoría, los estudios epidemiológicos y descriptivos que se han realizado utilizan a los marcadores de estrés oxidativo como indicadores de efecto para analizar la toxicidad al mercurio en poblaciones o trabajadores expuestos 2-6. Sin embargo, son escasos los reportes que relacionan el daño oxidativo, la actividad de las enzimas antioxidantes y los daños al material genético con la exposición ocupacional prolongada al mercurio. Con el presente estudio, pretendemos profundizar en el comportamiento de estos marcadores en un grupo de trabajadores expuestos a bajos niveles de mercurio por largos períodos de tiempo.

MATERIAL Y MÉTODO

Se trata de un estudio de tipo descriptivo, con un diseño transversal, llevado a cabo por el Instituto Nacional de Salud de los Trabajadores (INSAT) y el Centro Nacional de Genética Médica (CNGM) entre los años 2009 y 2011.
La muestra estuvo conformada por 12 trabajadores con exposición ocupacional al mercurio, procedentes de una clínica estomatológica ubicada en el municipio Arroyo Naranjo, provincia La Habana. Los mismos fueron entrevistados y mediante una encuesta; se recogieron los datos acerca del tiempo de exposición ocupacional (el que debía de ser superior a cinco años), los antecedentes patológicos, consumo de medicamentos y suplementos antioxidantes, así como los hábitos tóxicos como el consumo de alcohol y el tabaquismo. Además, fueron determinados los niveles de mercurio en orina, como parte del chequeo periódico que se les realiza a estos trabajadores.
La población de referencia estuvo conformada por 43 individuos sanos, en los cuales se constató que no estuvieran expuestos ocupacionalmente al metal y a los que se les realizaron estudios de laboratorio clínico (pruebas de función hepática, glicemia, creatinina, lipidograma y parámetros hematológicos) para descartar la presencia de otras enfermedades que pudieran relacionarse con el estrés oxidativo (EO). Además, se verificó la no utilización de suplementos antioxidantes y hábitos tóxicos como el consumo de alcohol y el tabaquismo.
Todos los participantes fueron incluidos luego de emitir voluntariamente su consentimiento, siguiendo los principios éticos de la Declaración de Helsinki de 1975, modificada en el 2008, además de ser revisado el protocolo de investigación por los comités de ética respectivos de las instituciones participantes.
En este estudio se utilizó como muestra biológica sangre venosa sistémica. La extracción se realizó en ayunas, mediante punción venosa en los laboratorios del Instituto Nacional de Salud de los Trabajadores (INSAT). Se extrajeron 7 ml de sangre, los cuales se distribuyeron de la siguiente forma: 2 ml en un tubo heparinizado para el ensayo Cometa y 5 ml en un tubo con EDTA para las determinaciones de EO.
Para las determinaciones de los marcadores de EO se utilizó el plasma, el que se obtuvo por centrifugación (a 2 500 rpm durante 5 minutos) y lisados de eritrocitos, muestras que fueron almacenadas a -20 ºC hasta el momento de su procesamiento (no más de diez días). Para la determinación del daño basal en el ADN se utilizaron linfocitos aislados de sangre periférica obtenidos por centrifugación, utilizando un gradiente de Histopaque 1 077.

Marcadores de daño oxidativo

Marcadores de defensa antioxidante

Análisis estadístico

En este estudio se determinaron los estadígrafos descriptivos de tendencia central para los marcadores de EO y genotoxicidad. Se compararon las medias aritméticas de cada una de las variables de respuesta para ambos grupos (expuestos y no expuestos), mediante la prueba U de Mann-Whitney para muestras independientes. Como criterio de significación estadística se tomó p<0,05. Para el análisis estadístico nos servimos del programa SPSS versión 13.0 para Windows.

RESULTADOS

El grupo de trabajadores estuvo conformado por 7 estomatólogos y 5 técnicos en estomatología (10 mujeres y 2 hombres), con una edad promedio de 43 años, (rango: 25-56 años). Los mismos tenían como promedio 20 años de exposición ocupacional al metal (rango: 6 a 33 años de exposición) y con niveles del metal en orina de 5,71 m g/L (rango: 2,25-18 m g/L).
El grupo control o no expuesto estuvo conformado por 43 sujetos (24 mujeres y 19 hombres), con una edad promedio de 39 años (rango: 25-65 años).
Como se observa en la tabla 1, las concentraciones plasmáticas de PAOP estaban incrementadas en los trabajadores expuestos, mientras que no se observaron diferencias entre los grupos en relación a las concentraciones de MDA.

Tabla 1
Marcadores de daño oxidativo en los trabajadores expuestos y controles

Marcadores de daño oxidativo

Trabajadores expuestos (n=12)

Controles (n=43)

MDA ( m mol/L)

0,55 ± 0,31

0,62 ± 0,34

PAOP ( m mol equiv/L)

76,41 ± 54,74 a

44,38 ± 35,47

Peróxidos totales ( m mol/L)

28,65 ± 12,56

4,22 ± 0,91

Daño al ADN (UA)

52,4 ± 18,0 a

31,5 ± 16,8

Los resultados están expresados como media ± desviación estándar
a Diferencias entre trabajadores expuestos y controles (p<0,05)

Se constató un aumento significativo del daño al ADN en los linfocitos de los trabajadores expuestos, en comparación con los controles. Interesantemente, en el grupo de trabajadores expuestos la concentración de peróxidos fue como promedio más elevada que en el grupo control, variando en un rango de 1 a 129 mmol/L, y para los controles desde 1 a 18 m mol/L, apreciándose una alta variación intraindividual, con un coeficiente de variación (CV) por encima del 50 %; debido a esto, no es posible apreciar las diferencias entre los grupos.

Como se aprecia en la tabla 2, las actividades intraeritrocitarias de las enzimas antioxidantes SOD1 y GR se encontraban incrementadas, mientras que la actividad de la CAT estaba disminuida en el grupo de trabajadores expuestos en comparación con la de los sujetos no expuestos. No se hallaron diferencias entre los grupos estudiados en cuanto a la actividad intraeritrocitaria de la glutatión peroxidasa. Por otra parte, los trabajadores expuestos presentaban una notable disminución en las concentraciones plasmáticas de los grupos tioles, referidos como glutatión reducido, así como una reducción de la capacidad antioxidante total a nivel plasmático.

Tabla 2
Marcadores de defensa antioxidante en los trabajadores expuestos y controles

Marcadores de defensa antioxidante

Trabajadores expuestos (n=12)

Controles (n=43)

SOD1 (U/mL)

180,2 ± 5,7 a

163,4 ± 0,34

CAT (U/mL)

86,6 ± 14,5 a

71,6 ± 30,8

c-GPx (mU/mL)

36762,3 ± 9204,6

25882,7 ± 4758,6

GR (mU/mL)

1139,9 ± 266,3 a

340,3 ± 52,3

Concentraciones de grupos tioles ( m mol/L)

8,68 ± 3,35 a

22,38 ± 3,31

Capacidad antioxidante total (mM Fe 2+ /L)

0,13 ± 0,05 a

0,21 ± 0,08

Los resultados están expresados como media ± desviación estándar
a Diferencias entre trabajadores expuestos y controles (p< 0,05)

Cuando se analizó cuales de estos marcadores de efecto podrían ser factores de riesgo debido a la exposición prolongada al mercurio, se encontró que los trabajadores expuestos mostraban un riesgo incrementado en 6,2 veces de presentar valores elevados de peróxidos (IC 95%: 1,3-30), de 9,3 veces de tener más daño al ADN (IC 95%: 1,3-30) y de presentar 16,5 veces más reducida la capacidad antioxidante del plasma (IC 95%: 1,3-30), que los individuos no expuestos, notando que, de eliminarse la exposición al mercurio, tanto los niveles de peróxidos, como el daño al ADN se reducirían en el 31 % y en un 51 %, respectivamente, en los trabajadores muestreados, así como se normalizaría la capacidad antioxidante en el 61 % de estos individuos expuestos.

DISCUSIÓN

El estrés oxidativo es uno de los mecanismos principales mediante el cual se explica la toxicidad de los metales pesados en los seres humanos. Se ha descrito que estos pueden inducir condiciones de estrés oxidativo, no solo mediante la generación de especies reactivas del oxígeno (ERO), sino también por la reducción de la capacidad de defensa antioxidante 2,4,5,15.
A pesar del cúmulo de evidencias que relacionan la exposición al mercurio con el aumento del daño oxidativo a las diferentes biomoléculas y la disminución de la defensa antioxidante, aún no está del todo esclarecido cómo se modifican los marcadores de estrés oxidativo en individuos expuestos ocupacionalmente a este metal por tiempos prolongados.
Los resultados derivados de este estudio indican que la exposición por largos período de tiempo a niveles de mercurio considerados como normales, provoca el aumento de las concentraciones de los PAOP, constituyendo este el primer reporte del comportamiento del marcador en trabajadores expuestos a este metal. Este indicador muestra el grado de oxidación de las proteínas plasmáticas, en especial de la albúmina, mediado por la acción de oxidantes clorinados como el ácido hipocloroso, el que es liberado fundamentalmente por los neutrófilos activados, por lo que es considerado, además, como un marcador de inflamación 7. En este sentido, se ha descrito que el mercurio, a bajas concentraciones, puede producir reacciones inmunes no deseadas como la inflamación o la autoinmunidad, lo que pudiera explicar el incremento de los niveles de este marcador 16. Por otra parte, teniendo en cuenta que este marcador está modificado fundamentalmente en las afecciones renales 7, el mismo podría ser utilizado como un biomarcador de efecto en el seguimiento periódico de estos trabajadores, con el objetivo de prevenir la aparición de complicaciones renales en los mismos.
En los trabajadores expuestos no se constató el aumento de las concentraciones de MDA, lo cual se podría explicar teniendo en cuenta los bajos niveles del metal que estos presentan. En relación con este marcador, se ha descrito que se encuentra elevado en los trabajadores expuestos al mercurio y que se relaciona directamente con las concentraciones presentes del metal 17. En concordancia con estos resultados, en un estudio similar al nuestro se reporta que los trabajadores que presentan bajos niveles de mercurio no presentan modificaciones en este marcador de peroxidación lipídica en comparación con los controles 18.
Varios autores han referido que el mercurio puede actuar como un pro-oxidante a través de la generación de H2O2 y por su elevada reactividad con los grupos tioles presentes en las proteínas 4,6. En relación con estos hallazgos, encontramos que, en los trabajadores expuestos, se aprecia una notable reducción en los niveles de grupos tioles. Estos resultados están en correspondencia con múltiples reportes de la literatura, los que describen la disminución de los niveles de los grupos tioles, fundamentalmente el GSH, debido a su unión con el metal, como el principal mecanismo mediante el cual el mercurio favorece la presencia de condiciones oxidativas 3,4,6,19.
La genotoxicidad causada por la exposición ocupacional a concentraciones relativamente bajas de mercurio, ha sido abordada por varios grupos de trabajo, encontrando incrementos significativos de los marcadores ensayados en los trabajadores o individuos expuestos a este metal 20. Los resultados de este estudio están en correspondencia con estos hallazgos. En este sentido, varios han sido los posibles mecanismos enunciados, mediante los cuales el metal puede generar genotoxicidad 20. Uno de ellos,está relacionado con la habilidad que tiene el mercurio de unirse a los grupos sulfidrilos y de inducir daño celular a través del aumento de las ERO. De acuerdo a los resultados obtenidos en este estudio, este pudiera ser el mecanismo potencial mediante el cual se explicaría el aumento del daño al material genético encontrado.
En relación con las actividades de las enzimas antioxidantes, los informes en la literatura son diversos; algunos autores reportan la inhibición de estas enzimas, relacionándolo con un estado de estrés oxidativo persistente 15,17,22, mientras otros muestran el aumento en la actividad de las mismas, en correlación directa con las concentraciones del metal 6. Los resultados derivados de este estudio indican que, debido a la exposición prolongada al mercurio, se observa un aumento significativo en las actividades de la SOD1 y la GR , mientras que la CAT se muestra disminuida drásticamente y no se advierten cambios en la actividad de la c-GPx.
En este caso, el incremento de las actividades sugiere la activación de los mecanismos de defensa homeostáticos, ya que como se ha descrito, solo a grandes dosis del metal las células pierden su capacidad de responder 23. En relación con la disminución de la CAT, se ha referido que el mercurio puede directamente inhibir la actividad de esta enzima 2,3; contradictoriamente, otros estudios sugieren la inducción de esta enzima, tanto a bajas como a elevadas concentraciones del metal, en respuesta al aumento en la generación del H2O2 6. Como en el presente estudio no se obtuvo un aumento significativo en los niveles de peróxidos y la actividad de la c-GPx no varió entre los grupos, la inhibición podría ser el principal factor que afectó la actividad de esta enzima.
El incremento de las concentraciones de proteínas oxidadas, la disminución en los niveles de los grupos tioles, unido a la baja capacidad antioxidante plasmática detectada, sugieren que el estado redox puede estar modificado a favor de la ocurrencia de reacciones oxidativas, resultados que, en su conjunto, suportan el hecho de que la exposición por largos períodos de tiempo al mercurio condiciona una situación de estrés oxidativo, lo que puede ser la causa que promueva los daños en el material genético detectado en los trabajadores expuestos.
Se ha descrito que las alteraciones en el estado redox celular pueden favorecer la aparición de las complicaciones más frecuentemente relacionadas al estrés oxidativo, como son la hipertensión arterial, las afecciones cardiovasculares y los procesos carcinogénicos 24, por lo que los marcadores propuestos en el presente estudio podrán ser utilizados como indicadores de efecto que permitan el control biológico cuando las alteraciones orgánicas puedan ser todavía reversibles, y de esta forma perfeccionar el seguimiento médico periódico que se realiza a estos trabajadores.
De acuerdo a los resultados obtenidos, en investigaciones futuras se deberá profundizar en el estudio de los marcadores que constituyeron factores de riesgo debido a la exposición prolongada al mercurio.

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Recibido: 21 de enero de 2013 Aprobado: 16 de octubre de 2013

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